胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞與絲素蛋白-羥基磷灰石材料在骨創(chuàng)傷修復(fù)中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、組織工程的原理是利用工程字方法和手段，將具有特定功能或分化潛能的細(xì)胞（種子細(xì)胞）與可降解生物材料（支架材料）共植入體內(nèi)，隨著種子細(xì)胞的不斷擴(kuò)增、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和生物材料的逐漸降解、吸收，最終形成具有正常結(jié)構(gòu)和功能的特定組織或器官。因此種子細(xì)胞和支架材料是組織工程研究的主要內(nèi)容。在組織工程的研究與應(yīng)用中，種子細(xì)胞的來(lái)源、分離純化、規(guī)模化擴(kuò)增等是制約其發(fā)展的重要瓶頸問(wèn)題之一。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs

2、)是來(lái)源于發(fā)育早期中胚層的一類(lèi)多能干細(xì)胞，在特定誘導(dǎo)條件下可分化為多種類(lèi)型的結(jié)締組織，形成骨、軟骨、骨骼肌、肌腱和脂肪等多種組織，而且具有采集方便、易于體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和誘導(dǎo)等特性，被認(rèn)為是一種理想的種子細(xì)胞。目前，骨髓來(lái)源的MSCs（bonemarrow-derivedMSCs，BMSCs)研究最多，但人BMSCs含量極低。近年來(lái)，已有具有干/祖細(xì)胞特征的間充質(zhì)細(xì)胞自骨髓、外周血、脂肪及肌肉等組織中分離，這些組織的共同特征是來(lái)源于胚胎發(fā)

3、育期的中胚層。胎盤(pán)由滋養(yǎng)細(xì)胞及大量起源于胚外中胚層的間充質(zhì)和血管共同組成，提示胎盤(pán)中存在MSCs成分。對(duì)胎盤(pán)來(lái)源的MSCs(placenta-derivedMSCs，PMSCs)的研究也已展開(kāi)。實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可以從胎盤(pán)組織分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞并且這些細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的細(xì)胞生物學(xué)特性。由于可以在體外預(yù)先建立胎盤(pán)MSCs庫(kù)，實(shí)現(xiàn)即時(shí)使用，所以PMSCs在組織工程研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 骨組織工程學(xué)要

4、求材料具有適宜的降解速率，使支架材料在一定時(shí)間內(nèi)吸收，形成具有功能活性的自身骨組織。骨替代材料降解過(guò)快不能提供新骨形成的支架，降解過(guò)慢則阻礙新骨的生長(zhǎng)及骨塑形，影響功能活性的自身骨組織形成。羥基磷灰石是骨組織主要的礦物質(zhì)成分，以其良好的生物相容性和生物活性引起研究人員的重視。然而羥基磷灰石材料降解速度非常緩慢，而且脆性大、柔韌性差。絲素具有生物相容性和生物可降解性，絲素特別是家蠶絲素是純天然，極易獲取且價(jià)格低廉的一種。以往研究表明絲素材

5、料可以支持入骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)和體外增殖，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞、鈣鹽沉積以及骨性結(jié)構(gòu)、骨小梁的形成。然而絲素硬度低，在外力作用下極易變形的特性使得單純的絲素難以適應(yīng)移植環(huán)境。因此，構(gòu)造一種新型的絲素材料使其同時(shí)具有一定的硬度和韌性以及適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能以適應(yīng)移植組織的結(jié)構(gòu)并運(yùn)用于骨組織工程成為必然。羥基磷灰石降解緩慢、脆性大，而絲素蛋白機(jī)械強(qiáng)度差。將兩者復(fù)合，絲素蛋白能改善羥基磷灰石的理化性能，并可調(diào)控SF/HA的降解速率，

6、SF/HA復(fù)合材料具有良好的組織相容性，有望成為一種新的骨修復(fù)替代材料。
　　 本研究從胎盤(pán)分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(placentamesenchymalstemcells，PMSCs)并分析其免疫學(xué)特性，聯(lián)合絲素蛋白/羥基磷灰石材料(silkfibroin/hydroxyapatite，SF/HA)對(duì)兔橈骨的節(jié)段性骨缺損進(jìn)行修復(fù)，以評(píng)價(jià)PMSCs和SF/HA材料在骨組織工程中應(yīng)用的可能性和價(jià)值。
　　 第一部分
　

7、　 目的：探索間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)在人胎盤(pán)組織中的分布規(guī)律以及體外分離培養(yǎng)的方法。
　　 方法：取正常剖宮產(chǎn)之足月健康產(chǎn)婦的新鮮胎盤(pán)組織，按中央帶(A)、中間帶(B)、邊緣帶(C)全層連續(xù)切片，以抗CD166、抗CD90、抗CD29分別作免疫熒光和免疫組化染色，顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞分布區(qū)域，采用HPIAS-1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖象處理，同時(shí)應(yīng)用整體灌注的方法分離細(xì)胞，常

8、規(guī)的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)志及其分化潛能。
　　 結(jié)果：3個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記分子CD166、CD90、CD29陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，主要分布于血管內(nèi)皮下及血管附近間質(zhì)內(nèi)和胎盤(pán)中央帶，陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)度在不同部位具有顯著性差異（P<0.05））；整體灌注方法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，表達(dá)CD73、CD90、CD166和CD105，不表達(dá)CD34、CD45、CD14和CD106，呈現(xiàn)PMSCs表型；體外擴(kuò)增培養(yǎng)的PM

9、SCs成骨誘導(dǎo)后，由長(zhǎng)梭形向立方形轉(zhuǎn)變，VonKossa染色可見(jiàn)細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)并出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)；成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)的PMSCs油紅O染色陽(yáng)性；成軟骨誘導(dǎo)2周后，PMSCs形態(tài)逐漸變得扁平，anti-collagentypeII免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原；向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)ld后大多數(shù)PMSCs轉(zhuǎn)變?yōu)殡p極或多極神經(jīng)元細(xì)胞樣形態(tài)，伸出突觸，染色可見(jiàn)NSE、GFAP陽(yáng)性；向內(nèi)皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)7天以后，PMSCs逐步回縮，立體感增強(qiáng)，KDR以

10、及v-WF染色結(jié)果不同程度陽(yáng)性。
　　 結(jié)論：胎盤(pán)各部位均存在表達(dá)CD166、CD90、CD29陽(yáng)性的間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞的分布與血管有一定的相關(guān)性，整體灌注的方法可以分離細(xì)胞，臍帶附著處下方胎盤(pán)組織相對(duì)其他部位而言可能為MSCs富集區(qū)域，體外擴(kuò)增培養(yǎng)的PMSCs具有向成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)元樣和內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的潛能。
　　 第二部分
　　 目的：探討PMSCs的免疫學(xué)特性及與絲素蛋白(silkfibroin，SF

11、)的相容性。
　　 方法：采用人以及兔雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MixedLymphocyteReactions，MLR)體系，根據(jù)不同比例加入絲裂霉素處理過(guò)的PMSCs，3H摻入法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖率并用ELISA法測(cè)定混合培養(yǎng)上清液中IL-2和IFN-y的含量；運(yùn)用SF溶液包被的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)PMSCs，流式細(xì)胞術(shù)分析其表型并對(duì)其定向分化潛能進(jìn)行探討，進(jìn)一步觀察其對(duì)MLR體系中淋巴細(xì)胞增殖的影響；PMSCs置于SF膜材料培養(yǎng)后通過(guò)掃描

12、電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 結(jié)果：PMSCs可以抑制人或兔混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中淋巴細(xì)胞的增殖，抑制率與加入的PMSCs數(shù)量成正比，同時(shí)PMSCs可以減少混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中細(xì)胞因子IL-2、IFN-y的分泌；用SF溶液包被的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的PMSCs，其生長(zhǎng)特性、表面標(biāo)志、多向分化潛能無(wú)明顯變化；PMSCs在SF膜材料上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)8d時(shí)材料上細(xì)胞伸展增殖，分泌大量的的顆粒狀、網(wǎng)狀基質(zhì)物質(zhì)，材料間隙被基質(zhì)填滿。
　　 結(jié)

13、論：PMSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用；SF材料不影響PMSCs的生長(zhǎng)特性、表面標(biāo)志和多向分化潛能，具有良好的生物相容性。
　　 第三部分
　　 目的：探討PMSCs聯(lián)合絲素蛋白/羥基磷灰石材料(silkfibroin/hydroxyapatite,SF/HA)對(duì)兔橈骨的節(jié)段性骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)PMSCs和SF/HA材料在骨組織工程中的應(yīng)用價(jià)值及其機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用BrDU標(biāo)記PMSCs并聯(lián)合SF/HA材料移植

14、下列兔橈骨缺損部位，24只新西蘭大白兔制成橈骨中段1.5cm長(zhǎng)的骨缺損模型，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（植入PMSCs/SF/HA)、對(duì)照組(植入SF/HA)、空白組（不植入修復(fù)材料）共3組。術(shù)后2、4、8、12周分別行大體觀察、組織學(xué)觀察和X線觀察，評(píng)分比較3組骨缺損修復(fù)的情況。
　　 結(jié)果：兔橈骨缺損植入修復(fù)術(shù)后2、4、8、12周，影像和組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，新骨生成在實(shí)驗(yàn)組均優(yōu)于對(duì)照組，空白組各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)新骨形成。術(shù)后8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組移植部

15、位免疫熒光染色仍可見(jiàn)BrDU陽(yáng)性細(xì)胞存在。術(shù)后8周和12周，評(píng)分比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨折愈合有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：SF/HA材料與PMSCs聯(lián)合移植能夠修復(fù)兔橈骨缺損，可以作為組織工程骨的支架材料和種子細(xì)胞的來(lái)源。
　　 綜上所述，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)各部位均存在表達(dá)CD166、CD90、CD29陽(yáng)性的間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞的分布與血管有一定的相關(guān)性，整體灌注的方法可以分離細(xì)胞，體外擴(kuò)增培養(yǎng)的PMSCs具有