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1、中國(guó)組織工程研究 第 21 卷 第 13 期 2017–05–08 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research May 8, 2017 Vol.21, No.13P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 2074·研究原著·www.CRTER.org牛婷,女,1990 年生,安徽省淮北市
2、人,漢族,武漢大學(xué)人民醫(yī)院在讀碩士,主要從事生殖內(nèi)分泌及不孕不育等方面的研究。通訊作者:李愛(ài)斌,博士,主任醫(yī)師,武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖中心,湖北省武漢市 430060中圖分類號(hào):R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):2095-4344(2017)13-02074-07稿件接受:2016-12-09Niu Ting, Studying for master’s degree, Reproductive Medical Center, Ren
3、min Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, ChinaCorresponding author:Li Ai-bin, M.D., Chief physician, Reproductive Medical Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,
4、China實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性 SD 大鼠。造模 造模:熱損傷法建立子宮內(nèi)膜損傷模型。分組干預(yù) 分組干預(yù):宮腔移植組:宮腔局部注射同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞懸液 1 mL;宮腔對(duì)照組:宮腔注射等量的PBS;尾靜脈移植組:尾靜脈注射同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞懸液 1 mL;尾靜脈對(duì)照組:尾靜脈注射等量PBS。觀察指標(biāo) 觀察指標(biāo):于大鼠第 3 個(gè)動(dòng)情期時(shí)將造模雌鼠與雄鼠合籠,觀察陰栓,在觀察到陰栓的當(dāng)天處死造模大鼠,游離出子宮組織,進(jìn)行子宮
5、內(nèi)腺體計(jì)數(shù)、免疫組織化學(xué)及 Western blot 檢測(cè)。結(jié)果 結(jié)果:胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞移植可不同程度地修復(fù)大鼠子宮內(nèi)膜損傷組織,增加子宮內(nèi)膜腺體計(jì)數(shù),改善子宮內(nèi)膜容受性。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)受損子宮內(nèi)膜牛 婷,李愛(ài)斌,陳 力(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖中心,湖北省武漢市 430060)引用本文:牛婷,李愛(ài)斌,陳力. 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)受損子宮內(nèi)膜[J].中國(guó)組織工程研究,2017,21(13):2074-2080.DOI:10.39
6、69/j.issn.2095-4344.2017.13.018 ORCID: 0000-0001-6098-3289(牛婷)文章快速閱讀:文題釋義:胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞:是成體干細(xì)胞的一種,來(lái)源豐富,標(biāo)本易于獲取,且可向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及肝細(xì)胞等方向分化,臨床應(yīng)用不存在免疫排斥、不涉及倫理問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn),因此被認(rèn)為是成體干細(xì)胞的理想來(lái)源,在骨組織修復(fù)、血管損傷領(lǐng)域及妊娠期高血壓疾病等方面均有關(guān)于胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。動(dòng)物及臨床研
7、究均顯示了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在現(xiàn)代細(xì)胞治療領(lǐng)域及組織工程領(lǐng)域的巨大潛力。整合素 αvβ3:整合素是由 α、β 亞單位組成的細(xì)胞表面受體,αvβ3 在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)很重要。Lessey 等發(fā)現(xiàn) αvβ3 表達(dá)在排卵后的黃體中期的子宮內(nèi)膜,早孕的蛻膜中也存在,與“著床窗”的時(shí)間相吻合。有研究者對(duì)行試管助孕患者的子宮內(nèi)膜進(jìn)行活檢,然后檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織 ανβ3 的表達(dá)情況,結(jié)果顯示 ανβ3表達(dá)較高的患者妊娠率也更高,很多研究表明整合素是子宮
8、內(nèi)膜容受性的標(biāo)志之一,因而,ανβ3 的表達(dá)強(qiáng)度可以作為評(píng)價(jià)修復(fù)效果的指標(biāo)之一。摘要背景:胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源豐富,易于獲取,可向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及肝細(xì)胞等方向分化,臨床應(yīng)用不存在免疫排斥、不涉及倫理問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn),因此被認(rèn)為是成體干細(xì)胞的理想來(lái)源。目的:觀察同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠子宮內(nèi)膜損傷的情況。方法:取雌性 SD 大鼠,通過(guò)熱損傷法建立子宮內(nèi)膜損傷模型,造模后第 15 天,將造模成功的 40 只大鼠隨機(jī)分為 4 組,宮
9、腔移植組于宮腔局部注射同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞懸液 1 mL,宮腔對(duì)照組于宮腔注射等量的 PBS,尾靜脈移植組于尾靜脈注射同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞懸液 1 mL,尾靜脈對(duì)照組于尾靜脈注射等量 PBS。于大鼠第 3 個(gè)動(dòng)情期時(shí)將造模雌鼠與雄鼠合籠,觀察陰栓,在觀察到陰栓的當(dāng)天處死造模大鼠,游離出子宮組織,進(jìn)行子宮內(nèi)腺體計(jì)數(shù)、免疫組織化學(xué)及 Western blot 檢測(cè)。結(jié)果與結(jié)論:①腺體計(jì)數(shù):宮腔移植組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量多于其余 3 組(
10、P < 0.05),尾靜脈移植組多于宮腔對(duì)照組、尾靜脈對(duì)照組(P < 0.05);②子宮內(nèi)膜整合素 αVβ3 表達(dá):免疫組織化學(xué)及 Western blot 檢測(cè)均顯示宮腔移植組整合素 αVβ3 強(qiáng)于其余 3 組(P < 0.05),尾靜脈移植組多于宮腔對(duì)照組、尾靜脈對(duì)照組(P < 0.05);③結(jié)果表明:胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞移植可不同程度地修復(fù)大鼠子宮內(nèi)膜損傷組織,增加子宮內(nèi)膜腺體計(jì)數(shù),改善子宮內(nèi)膜容受性。關(guān)鍵詞:
11、干細(xì)胞;移植;胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞;子宮內(nèi)膜損傷;修復(fù);ανβ3;湖北省自然科學(xué)基金主題詞:干細(xì)胞移植;子宮內(nèi)膜;胎盤;整合素 αVβ3;組織工程基金資助:湖北省自然科學(xué)基金(2014CFB206)縮略語(yǔ):胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞:placental mesenchymal stem cells,PMSCsThe use of placental mesenchymal stem cells to repair the damaged endome
12、trium Niu Ting, Li Ai-bin, Chen Li (Reproductive Medical Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China)同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠子宮內(nèi)膜損傷牛婷,等. 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)受損子宮內(nèi)膜P.O. Box 10002, Shenyang 110180
13、 www.CRTER.org 2076www.CRTER.orgDawley(SD)大鼠各數(shù)只,體質(zhì)量200 g左右,SPF級(jí)別,由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào):SYXK(鄂)2015-0027,實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:PMSCs細(xì)胞由武漢大學(xué)2012級(jí)碩士研究生曹景云所贈(zèng)。主要試劑:DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone公司);胎牛血清(杭州四季青公司);二甲基亞砜(Sigma公司);免疫組化試劑盒、一抗兔抗
14、鼠ανβ抗體、二抗羊抗兔IgG抗體(Bioss公司);蘇木精-伊紅染色試劑盒(百浩生物科技公司);DAB染色劑(武漢博士德);BAC蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Pierce公司)。1.4 實(shí)驗(yàn)方法大鼠子宮內(nèi)膜損傷的模型制備:按照曲軍英等[10]的熱損傷的原理方法來(lái)制備大鼠子宮內(nèi)膜損傷的模型,具體步驟如下:取90只SD大鼠電子稱重器來(lái)稱質(zhì)量,按100 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉;待小鼠完全麻醉后,用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒皮膚,捫及膀胱
15、,在其上方縱行剪開(kāi)2.0 cm切口,找到子宮,緩慢挑出;10 mL注射器抽取于8 mL 80 ℃預(yù)熱生理鹽水,取“Y”型子宮一側(cè)(取左側(cè))近左右兩側(cè)子宮匯合處,用10 mL注射器針頭穿入子宮后,展平子宮,待其在子宮腔內(nèi)穿行約 3 cm后,將針頭從另一側(cè)宮腔刺出,出后接一皮管,將熱水導(dǎo)入廢液缸中;然后用同樣方法熱損傷其他大鼠子宮內(nèi)膜組織,熱水推畢后,緩慢拔出注射器針頭,整平并復(fù)位子宮,生理鹽水沖洗腹腔;無(wú)菌針線縫合腹部皮膚及皮下組織,轉(zhuǎn)移
16、至干凈鼠籠,苦味酸做好記號(hào),記錄日期,待其麻醉清醒后,送回動(dòng)物房;硫酸慶大霉素(8 IU 2 mL/支稀釋成1 000 U/mL)術(shù)后連續(xù)3 d腹腔內(nèi)注射2 mL稀釋后的慶大霉素。模型制備后 1,2,7, 14 d,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)斷頸處死10只大鼠,縱向剪開(kāi)腹壁,找到大鼠子宮,觀察并記錄處理后的情況,剪取處理側(cè)子宮組織0.5 cm,40 g/L多聚甲醛固定24 h;然后用PBS清洗,放于包埋器內(nèi),經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、蘇木精-伊紅染
17、色步驟,正置顯微鏡下觀察結(jié)果并進(jìn)行拍照。將子宮內(nèi)膜處理后15 d的10只大鼠與雄鼠合籠,大鼠與雄鼠在17:00合籠,雌、雄比例 3∶1,孕12 d時(shí)處死孕鼠,觀察雙側(cè)子宮受孕情況。若實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠死亡,則以同樣方法重新造模增補(bǔ)。分組干預(yù):造模后第15天,將造模成功的剩余40只雌性SD大鼠隨機(jī)分4組干預(yù),每組10只:宮腔移植組沿原切口打開(kāi)腹腔,挑出左側(cè)內(nèi)膜損傷側(cè)子宮,用1 mL注射器取1×1010 L-1的第3代PMSCs細(xì)
18、胞懸液1 mL,將細(xì)胞懸液緩慢注射至宮腔內(nèi),留針20 s,以利于細(xì)胞彌散,復(fù)位子宮, 1 mL生理鹽水沖洗腹腔,逐層關(guān)腹,將大鼠移至37 ℃恒溫板上,麻醉醒后送回動(dòng)物房,并進(jìn)行標(biāo)記;宮腔對(duì)照組按照宮腔移植組方式在宮腔注射等量的PBS;尾靜脈移植組于尾靜脈注射1×1010 L-1的第3代PMSCs細(xì)胞懸液1 mL;尾靜脈對(duì)照組于尾靜脈注射等量PBS。1.5 主要觀察指標(biāo)細(xì)胞移植后取材及觀察:細(xì)胞移植后,通過(guò)陰道脫落
19、細(xì)胞學(xué)檢查,觀察大鼠的動(dòng)情周期,在第3個(gè)動(dòng)情周期的動(dòng)情期將造模鼠與雄鼠合籠,通過(guò)觀察陰栓來(lái)確定雌雄鼠是否交配,在觀察陰栓到陰栓后的當(dāng)天,處死造模雌鼠,游離出子宮組織,通過(guò)子宮內(nèi)膜腺體恢復(fù)情況、測(cè)定整合素ανβ3的表達(dá)檢測(cè)細(xì)胞移植后受損子宮內(nèi)膜的修復(fù)情況。圖 1 SD 大鼠正常子宮內(nèi)膜組織及熱損傷子宮內(nèi)膜組織(蘇木精-伊紅染色,×200)Figure 1 Normal or damaged endometrium in Sp
20、rague-Dawley rats (hematoxylin-eosin staining, ×200)圖注:圖中 A 為大鼠子正常宮內(nèi)膜組織;B 為熱損傷造模后第 1 天,內(nèi)膜間質(zhì)充血、水腫,毛細(xì)血管擴(kuò)張,其內(nèi)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞;C 為熱損傷造模后第 2 天,內(nèi)膜間質(zhì)仍有血管充血,宮腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的子宮內(nèi)膜組織碎片,子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)模糊、紊亂;D 為熱損傷造模后第 7天,子宮內(nèi)膜層變薄,腺體萎縮、變小,部分宮腔腔上皮內(nèi)膜處中斷;E
21、 為熱損傷造模后第 14 天,子宮腔變小,正常的內(nèi)膜組織較少,部分組織開(kāi)始纖維化,顯示為較多紅色組織。A BC D EA BC D圖 2 建立 SD 大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型Figure 2 Establishing animal models of endometrial damage in Sprague-Dawley rats圖注:圖中 A 為大鼠正常子宮解剖,B 為挑出左側(cè)子宮組織,C 為 80 ℃熱水持續(xù)通過(guò)注射器針頭熱損傷子
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