人骨髓間充質(zhì)干細胞與人脂肪間充質(zhì)干細胞在修復脊髓損傷中的比較研究.pdf

1、脊髓損傷（Spinal cord injury, SCI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)的一種嚴重創(chuàng)傷，是人類致殘的重要原因之一，全球每年新增140000例SCI患者，我國2002年北京地區(qū)SCI發(fā)生率為60/百萬人口。SCI可導致?lián)p傷平面以下不同程度癱瘓，而且SCI主要發(fā)生在青壯年人群中，從SCI中存活下來的患者其生活質(zhì)量嚴重下降，給家庭、社會帶來沉重的負擔。隨著近年我國工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的改變及醫(yī)

2、療搶救網(wǎng)絡建設的相對滯后，我國面臨SCI救治的現(xiàn)狀十分嚴峻。鑒于SCI的高致殘率及產(chǎn)生的嚴重社會負擔，尋求SCI新的有效治療方法成為目前研究熱點。SCI后病理生理變化與發(fā)病機制極為復雜。首先，脊髓由于機械性外傷導致組織撕裂、扭曲、壓迫等，伴隨著脊髓局部血循環(huán)障礙，出血、局部缺血、水腫、炎癥等進一步使脊髓細胞死亡。脊髓再生微環(huán)境惡化，局部軸突抑制因子產(chǎn)生，局部神經(jīng)遞質(zhì)濃度改變，尤其是鈣超載使脊髓白質(zhì)中的軸突變性，這些變化持續(xù)數(shù)天，稱之為初

3、次損傷;損傷不止于此，初次損傷可以激活體內(nèi)一系列細胞內(nèi)信號改變，其中一個重要的變化是星形膠質(zhì)細胞過度活化，分泌產(chǎn)生致密的膠質(zhì)瘢痕，抑制軸突再生。與此同時，由于損傷導致血腦屏障破壞，外周血的中性粒細胞、巨噬細胞等浸潤至損傷局部，與脊髓內(nèi)部的小膠質(zhì)細胞協(xié)同進一步破壞脊髓再生環(huán)境，抑制軸突再生。為減輕SCI給患者帶來的傷害，學者們探討了諸多SCI的治療方法，包括:藥物治療、神經(jīng)營養(yǎng)因子、基因治療和細胞移植等。隨著干細胞領(lǐng)域研究的深入，干細胞移

4、植被證實是修復SCI十分有希望的手段。已有多種類型的干細胞被嘗試應用于不同動物SCI模型甚至Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗中。理論上，由囊胚的內(nèi)細胞層分離而來的胚胎干細胞，可跨胚層分化，具有方向分化潛能(pluripotency)，是移植的最佳選擇，但由于受倫理學限制及潛在的致畸性與致瘤性，其應用前景受限;CNS干細胞分化能力強，但在神經(jīng)發(fā)育過程中數(shù)量逐漸減少而且傳代后細胞易老化，同時也受倫理學限制，影響其臨床應用;誘導多能干細胞由于其技術(shù)要求較高，

5、難以獲取足夠數(shù)量的細胞;雪旺細胞與嗅鞘細胞移植療效較好，但取材難度大，難以擴增出足夠的細胞量，不適于臨床應用。成體間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)來源廣泛，取材方便，不受倫理學限制，并可經(jīng)過改造，成為一個良好的載體，有望成為臨床移植修復SCI良好的細胞來源。
　　 自從發(fā)現(xiàn)MSCs后，人們即嘗試移植MSCs修復CNS損傷疾病模型，其中MSCs移植治療SCI動物模型已近二十年。大量文獻報道取得

6、部分令人鼓舞的結(jié)果，但在動物實驗中，MSCs移植修復仍無突破性成果。究其原因，除SCI本身病理生理變化極端復雜，單純MSCs移植難以對抗所有的病理變化之外，結(jié)合參考文獻，我們認為還存在以下原因:(1) MSCs修復SCI的機制尚未闡釋清楚。誠然，動物實驗中MSCs移植修復SCI療效肯定，臨床Ⅰ、Ⅱ期試驗進一步提示MSCs可用于移植治療SCI。但其修復機制是細胞替代？營養(yǎng)因子？抗凋亡？抗炎癥？目前尚無確切回答;(2) MSCs的來源問題。

7、MSCs最早是從骨髓中分離獲取，即骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSC)，目前關(guān)于MSCs移植修復各種疾病模型大都也是以BMSC完成的。但培養(yǎng)BMSC需抽取大量的骨髓（約100ml），有一定的風險，包括感染、疼痛等，而且BMSC傳至7-8代后細胞易老化，其分泌營養(yǎng)因子功能下降。究竟哪一種MSCs是最適合移植修復SCI，目前仍無可靠的數(shù)據(jù)供參考，這也是本研究考慮的重

8、點。(3)MSCs的跨胚層分化問題。MSCs作為中胚層來源的細胞，不但能骨、軟骨、脂肪等細胞轉(zhuǎn)化，已有研究報道，MSCs在體內(nèi)及體外均擁有向神經(jīng)外胚層細胞（神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞等）轉(zhuǎn)化的能力。是否有必要在移植前對MSCs進行神經(jīng)誘導，目前仍存在爭議。鑒于分離培養(yǎng)BMSC面臨如上所述的困難，尋求MSCs另一種可靠的來源就顯得格外重要。為此，人們進行了廣泛的探索。包括:臍帶間充質(zhì)干細胞、臍血間充質(zhì)干細胞、胎盤間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞等

9、。在眾多的MSCs中，由于脂肪組織來源廣泛、易于獲取、無倫理學限制，脂肪間充質(zhì)干細胞（Adipose derived mesenchymal stem cell，ADSC）尤為引人注意。ADSC移植治療不同器官損傷已經(jīng)有不少文獻報道，并取得了一些令人滿意的結(jié)果。但關(guān)于ADSC與BMSC在移植修復SCI中有何不同效果，ADSC是否能取得像BMSC一樣的或者更好的效果，目前尚無全面的數(shù)據(jù)可參考。本研究擬在以往研究的基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)、體外實驗

10、，力爭較全面的比較分析ADSC與BMSC在修復大鼠SCI中的異同點，并試圖分析產(chǎn)生這些異同點的機制，為臨床應用MSCs移植修復SCI提供理論與實驗支持。目前國外已有兩個研究分別比較了ADSC與BMSC在修復大鼠心肌梗塞與缺血性腦卒中的不同療效，這些研究所用種子細胞均是鼠來源的間充質(zhì)干細胞。目前采用人來源的干細胞移植治療大鼠SCI的報道越來越多，比如人牙髓間充質(zhì)干細胞、人臍帶間充質(zhì)干細胞、人胎盤間充質(zhì)干細胞、人誘導多能干細胞等。另外，從將

11、來臨床應用角度考慮，人來源間充質(zhì)干細胞移植更符合臨床應用實際。基于便于與以往研究數(shù)據(jù)比較和臨床實際考慮，本研究所用間充質(zhì)干細胞均為人來源的ADSC(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，hADSC)與人來源的BMSC(human bone-derived mesenchymal stem cell，hBDSC)。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：人骨髓間充質(zhì)干細

12、胞與人脂肪間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)及生物學性狀的比較研究。
　　 目的：分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSC)與人脂肪間充質(zhì)干細胞(hADSC)，充分比較兩者的生物學特征。
　　 方法：收集5名在我科行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的成年志愿者（年齡:45-60歲，無其他基礎(chǔ)疾?。?，術(shù)前簽署知情同意書。術(shù)中分別收集其皮下脂肪組織與骨髓組織。采用梯度密度離心法分離培養(yǎng)hBMSC;采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)hADSC。為減小實驗誤差，細胞培養(yǎng)過

13、程中所用的培養(yǎng)基、胰酶、血清等兩種細胞均一致。細胞長至80％滿后胰酶消化傳代。取生長良好的第4代細胞，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力、流式細胞計數(shù)進行細胞表型分析、細胞免疫熒光法鑒定表面蛋白、實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測營養(yǎng)因子mRNA表達、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunoadsordent assay, ELISA)法檢測細胞分泌營養(yǎng)因子功能。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤（(x)±s）來表示，并應用

14、SPSS13.0軟件進行分析。統(tǒng)計學方法采用兩樣本t檢驗及兩因素析因分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。
　　 結(jié)果：成功分離培養(yǎng)兩種間充質(zhì)干細胞。形態(tài)上，hADSC與hBMSC類似，均成紡錘形，具備典型的MSCs的形態(tài)學特征;流式檢測結(jié)果顯示hADSC與hBMSC均高表達間充質(zhì)標記物CD90(99.47％與99.31％)，CD105(97.98％與98.46％)和粘附分子CD29(99.23％與99.31％)，CD44(98

15、.37％與98.26％);低表達造血系細胞表面標記物CD34(0.05％與1.45％)，血管內(nèi)皮性抗原CD45(0.91％與0.64％)，單核細胞抗原CD11b(0.02％與1.76％)，和人類白細胞抗原HLA-DR(0.17％與1.45％)。細胞熒光證實，兩種細胞均表達間充質(zhì)干細胞標志物波形蛋白(vimentin)、層粘連蛋白（laminin）、纖連蛋白（fibronectin）與干細胞標志物巢蛋白(nestin);hADSC與hBM

16、SC有絲分裂標志物Ki67表達率分別為57.22％±5.76％、46.02±3.18％，差異有統(tǒng)計學意義(t=-5.381，P=0.000);傳代后發(fā)現(xiàn)，hBMSC傳代至第7代左右即出現(xiàn)老化現(xiàn)象，增殖能力下降，而hADSC可傳代至30代無明顯變化。hADSC倍增時間明顯短于hBMSC，CCK-8增殖實驗結(jié)果表明，hADSC增殖速度顯著快于hBMSC(p＜0.05)。RT-PRC證實hADSC表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-deriv

17、ed neurotrophic factor，BDNF)，血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascularendothelial cell growth factor，VEGF)與肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF) mRNA水平顯著高于hBMSC(p＜0.05); ELISA實驗結(jié)果進一步證實，hADSC分泌BDNF、VEGF濃度高于hBMSC(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：本研究通過取自愿者皮下脂

18、肪與骨髓，成功建立了分離培養(yǎng)hBMSC與hADSC體系。與hADSC比較，hBMSC增殖速度較慢、易老化、分泌營養(yǎng)因子能力弱，脂肪組織可能更適合用于分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞。
　　 第二部分：入骨髓間充質(zhì)干細胞與人脂肪間充質(zhì)干細胞移植修復大鼠脊髓損傷的研究。
　　 目的：基于上一章的研究基礎(chǔ)，制備背側(cè)半切大鼠脊髓損傷模型，分別移植hADSC和hBSMC，比較兩者對SCI大鼠的修復效果，并分析其機制。
　　 方法：取第

19、四代hADSC與hBMSC，胰酶消化后調(diào)整細胞濃度為105/μl，備用。制備背側(cè)半切脊髓損傷模型（以中央導水管為標準）。將實驗動物隨機分成三組:Ⅰ:損傷對照組，SCI后注射PBS;Ⅱ:hADSC組，SCI后移植hADSC;Ⅲ:hBMSC組，SCI后移植hBMSC。以損傷點頭尾兩側(cè)各2mm為細胞移植點，將2×105個細胞移植到相應組別大鼠脊髓內(nèi)。移植術(shù)后不同時間點處死大鼠。研究比較各組動物BDNF蛋白表達水平、運動功能恢復(Basso-B

20、eattie-Bresnahan，BBB)、組織形態(tài)學修復、炎癥與凋亡反應、移植干細胞存活分化及神經(jīng)軸突再生等。為比較各組大鼠皮質(zhì)脊髓束再生情況，于移植術(shù)后第28天每組隨機選取大鼠5只，在大腦感覺運動皮層（前囟前2mm，中線旁2mm以內(nèi)）注射順行追蹤劑生物素葡聚糖胺(Biotinylated Dextran Amine，BDA)，2周后處死大鼠進行檢測。實驗中的所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤（(x)±S）表示，并用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行

21、統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學方法采用單向方差分析(one-way ANOVA)及兩因素析因分析(two-way ANOVA)。方差分析顯著而且方差檢驗齊的情況下，多重比較采用Bonferroni法;方差顯著而方差不齊的情況下，采用Welch法校正F檢驗及Dunnett T3多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。
　　 結(jié)果：⑴細胞存活、遷移、分化情況:細胞移植后一周，大鼠脊髓內(nèi)可見大量移植干細胞存活，定量分析發(fā)現(xiàn)hBMSC組與hADSC

22、組存活率為33.87％±4.45％，hADSC組為35.59％±5.38％，差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.427，P=0.692)。至第四周時，大部分移植細胞均死亡，hBMSC組與hADSC組存活率分別為0.87％±0.25％和0.95％±0.33％(t=-0.337，P=0.753);兩種細胞的遷移方式類似，均能從移植點向損傷邊緣遷移;兩種細胞在宿主體內(nèi)的分化情況十分類似，本研究未觀察到移植干細胞分化為β-tubulin陽性神經(jīng)元，NF

23、200陽性神經(jīng)絲，GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞，CNPase陽性少突膠質(zhì)細胞與S100陽性雪旺細胞;兩種細胞的宿主體內(nèi)的分裂狀況也十分相似，絕大部分移植的間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)不再繼續(xù)表達Ki67，未見聚集分布的Ki67陽性細胞。⑵運動功能恢復情況:脊髓損傷后所有動物BBB評分均為0，此后逐漸恢復，一周時BBB評分恢復至4-5分，在前2周各組大鼠BBB評分差異無統(tǒng)計學意義，第2周開始，hADSC組大鼠BBB評分顯著高于hBMSC組與損傷對照組，

24、并一直持續(xù)到實驗結(jié)束，術(shù)后4周hADSC組、hBMSC組與對照組大鼠BBB評分分別為12.5±0.5、11.2±0.6與9.2±0.3。⑶軸突再生情況:單向方差分析顯示，SCI后第4周，各組大鼠損傷周邊NF200陽性纖維數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(F=115.816，P=0.000)，hADSCs組與hBMSCs組顯著高于損傷對照組，而且hADSCs組的數(shù)目最多。各組動物5-HT陽性纖維數(shù)目再生情況與NF200類似。對于皮質(zhì)脊髓束纖維，在損傷頭

25、側(cè)，各組均可見大量的BDA陽性纖維，而在損傷點尾端，各組均無再生的BDA陽性皮質(zhì)脊髓束纖維。⑷BDNF表達情況:Westernblot結(jié)果表明，MSCs移植組大鼠術(shù)后第3天BDNF蛋白表達水平明顯高于損傷對照組，而且以hADSC組表達最高(P＜0.05);ELISA檢測進一步證實移植術(shù)后第3天、第7天hADSC組大鼠脊髓BDNF濃度顯著高于hBMSC組與損傷對照組(P＜0.05)。⑸炎癥與凋亡:脊髓損傷后，由于炎癥與凋亡導致大量細胞死亡

26、，形成不利于神經(jīng)再生的脊髓內(nèi)環(huán)境。MSCs移植可減輕損傷周邊炎癥與凋亡反應。析因方差分析顯示，不同組動物ED-1+陽性面積有顯著差異(F組別=622.460，P組別=0.000)，時間對動物ED-1+陽性面積有顯著影響(F時間=240.320，P時間=0.000)，時間與分組存在交互效應（F時間×分組=19.025，P時間×分組=0.000）。經(jīng)單因素ANOVA分析，在損傷后1周及4周，MSCs移植顯著下調(diào)損傷周邊ED-1陽性炎癥細胞數(shù)

27、目，三組之間比較差異有統(tǒng)計學意義，以hADSC組下降的最明顯(P＜0.05)。凋亡分析結(jié)果顯示，在細胞移植后1周hADSC組與hBMSC組、損傷對照組比較，caspase-3陽性細胞數(shù)顯著減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：hADSC移植到SCI大鼠體內(nèi)后未見腫瘤形成等不良反應，hADSC促進SCI大鼠功能恢復的效果優(yōu)于hBMSC，其機制可能與提高脊髓內(nèi)BDNF表達水平、下調(diào)炎癥與凋亡、促進軸突再生有關(guān)。hADSC可替代hBMS