奶牛泌乳期乳汁中IgA的檢測及消長規(guī)律.pdf

1、分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIgA)是黏膜免疫最重要的執(zhí)行者，是外分泌液中存在的一種最主要的抗體。SIgA在黏膜免疫中通過免疫清除、免疫屏障及中和作用等將病原微生物排出體外，達到保護機體的目的。分泌乳汁的乳腺因產(chǎn)生SIgA為主的抗體而作為整個黏膜免疫系統(tǒng)的一部分。乳汁中SlgA能特異性預(yù)防新生仔畜胃腸道感染。 本研究將牛初乳經(jīng)10000r/min離心所得的乳清過葡聚糖G-200凝膠

2、層析柱得IgA和IgG混合蛋白，再過纖維素DEAE-52柱純化牛IgA，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為單體IgA。免疫兔制備兔抗牛IgA抗體，然后用辣根過氧化酶標記，制備兔抗牛IgA酶標抗體。應(yīng)用本研究建立雙抗體夾心ELISA對吉林春光奶牛場和吉林農(nóng)大南場具有代表性的樣品進行檢測，為深入研究黏膜免疫及與黏膜免疫有關(guān)的疾病提供一定依據(jù)。 采用鼠抗牛IgA血清粗提蛋白作為包被抗原，建立用于檢測牛乳中IgA的雙抗體夾心ELISA。雙抗體

3、夾心ELISA程序：鼠抗牛IgA抗體以包被液(碳酸鹽緩沖液)稀釋成最適包被濃度30ug/ml，分別吸取100μl，包被反應(yīng)板置37℃溫育3h后，再于4℃冰箱過夜，同時各板設(shè)初乳和酶標抗體對照。次日甩去包被液，以含0.05％Tween-20的0.01Mmol/LpH7.4.PBS(PBST)作為洗滌液，洗滌3次，每次3min(以下簡稱3×3 min洗滌)。將牛乳用稀釋液二倍稀釋，每孔加入100μl，37℃溫育1h，3×3 min洗滌。將兔

4、抗牛酶標抗體用0.05％BSA-PBST液稀釋至工作濃度，每孔加入100μl，37℃溫育1h，3×3 min洗滌。每孔加入新配制的底物(OPD)溶液100μl，37℃濕盒避光作用20min。每孔加2M H<,2>SO<,4>一滴終止反應(yīng)，以DG-3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD值(波長490nm)，判定結(jié)果。 先對吉林春光奶牛場的178頭無乳房炎的奶牛分四個乳區(qū)進行采樣，將采集的688份奶樣應(yīng)用本研究建立的雙抗體夾心EIJSA