奶牛乳腺發(fā)育及泌乳重要功能基因的篩選.pdf

1、奶牛是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的重要經(jīng)濟動物之一，奶牛的乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)是衡量養(yǎng)殖水平和經(jīng)濟效益的重要標準。我國雖是世界奶牛養(yǎng)殖大國，但奶牛的年平均單產(chǎn)低于世界平均水平。乳脂率和乳蛋白含量也相對較低，嚴重影響消費者的消費需求。乳是由乳腺自身合成和分泌的，乳腺發(fā)育及泌乳過程中重要功能基因的表達變化是調(diào)節(jié)乳腺生長、發(fā)育、分化以及乳汁合成、分泌、轉(zhuǎn)運等重要生理過程的基礎(chǔ)。因此，對乳腺發(fā)育和泌乳重要功能基因的篩選及功能鑒定對奶牛遺傳性能的改善、促進我國奶業(yè)的

2、發(fā)展有積極作用。
　　 奶牛乳腺在泌乳期是乳汁合成和分泌旺盛時期，受多種基因協(xié)同調(diào)節(jié)。為揭示奶牛乳腺在泌乳期相對于其他發(fā)育時期差異表達基因，本實驗采用Affymetrix公司的牛基因組表達譜芯片對荷斯坦奶牛不同發(fā)育時期差異表達的基因進行篩選，并通過泌乳期同青春期、妊娠期和干乳期奶牛乳腺組織中基因表達情況的對比，獲得泌乳期奶牛乳腺基因表達譜，同時使用熒光定量RT-PCR技術(shù)對芯片結(jié)果進行驗證。結(jié)果顯示，泌乳期與青春期、妊娠期及干乳

3、期奶牛乳腺對比，共篩選出差異表達基因567個，其中泌乳期高表達基因163個，泌乳期低表達基因404個。熒光定量RT-PCR方法對芯片結(jié)果進行驗證也顯示出與芯片結(jié)果的一致性，表明通過基因芯片技術(shù)篩選奶牛泌乳期差異表達基因結(jié)果準確，可信度高。
　　 將篩選出的泌乳期特異性表達基因在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫中檢索，獲得基因功能的生物學(xué)注釋。結(jié)果顯示：在泌乳期奶牛乳腺中高表達的基因功能很大程度上和乳腺在此階段的生理功能相聯(lián)系。泌

4、乳期奶牛乳腺組織篩選出的主要功能基因集中在乳汁的合成和分泌上，同時也有同組織發(fā)育相關(guān)的功能基因出現(xiàn)。
　　 將篩選出的在泌乳期差異表達基因進行信號通路分析，得到泌乳期相對于其他各時期活躍的信號通路，有助于對泌乳期乳腺中各種分子事件進行解釋。
　　 根據(jù)基因芯片結(jié)果，在泌乳期高表達基因中選取Kcnmal和Ihh基因，對其在泌乳期的調(diào)控功能進行驗證。采用基因過表達技術(shù)和RNA干擾技術(shù)分別對Kcnmal和Ihh基因進行正負調(diào)控

5、，分別增加和減少其在泌乳盛期奶牛乳腺上皮細胞中的表達，采用Western Blot和流式細胞儀檢測Kcnmal和Ihh基因表達量發(fā)生變化后，乳腺上皮細胞內(nèi)酪蛋白和磷酸化STAT5的表達變化，以及乳腺上皮細胞增殖活性變化。結(jié)果表明，Kcnmal基因有促進乳蛋白合成的作用（P<0.05），Kcnmal基因還具有促進細胞增殖的作用（P<0.05）。Ihh基因?qū)θ橄偕掀ぜ毎业鞍缀铣捎绊懖伙@著（P>0.05），對細胞增殖影響不顯著（P>0.05