α-,1-腎上腺素受體自身抗體在原發(fā)性高血壓患者血清中的分布及其對血管功能的影響.pdf

1、研究背景: 高血壓(hypertension，HT)是一種多基因遺傳與環(huán)境因素交互作用而產(chǎn)生的以動脈血壓升高為特征的全身性疾病，是導(dǎo)致其他心血管疾病的最重要的獨立危險因素，已成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。長期的高壓血流沖擊動脈血管管壁，會引起動脈內(nèi)膜機械性損傷，進(jìn)而造成血脂易在動脈壁沉積，形成脂肪斑塊并造成動脈硬化狹窄。加之由于全身細(xì)小動脈長期反復(fù)痙攣，特別是全身細(xì)、小動脈硬化，可造成心臟、腦、腎臟等重要臟器的缺血性病變。盡管世界范圍內(nèi)在

2、高血壓的預(yù)防、監(jiān)測和治療等方面有了很大的進(jìn)步，但目前仍有約70％的高血壓患者的血壓得不到理想的控制，也不能從根本上逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展和最終防止其并發(fā)癥的發(fā)生，提示在高血壓發(fā)生發(fā)展過程中可能還有其它未知因素的參與。 一、原發(fā)性高血壓患者血清中α1腎上腺素受體自身抗體的檢測及其免疫學(xué)特征分析。 目的: 本研究分別以合成的人α1—AR細(xì)胞外第一環(huán)、第二環(huán)、第三環(huán)作為抗原肽段，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)技術(shù)，檢測原發(fā)性高血壓

3、患者以及血壓正常的健康人群血清中抗α1—AR細(xì)胞外第一環(huán)自身抗體(anti—α1—EC1)、抗α1—AR細(xì)胞外第二環(huán)自身抗體(anti—α1—ECⅡ)以及抗α1—AR細(xì)胞外第三環(huán)自身抗體(anti—α1—ECⅢ)的分布情況，以證實哪一種α1—AR的細(xì)胞外環(huán)有可能成為免疫反應(yīng)靶位，及其在原發(fā)性高血壓患者血清中的分布規(guī)律和可能的意義。 方法： 1．檢測對象： (1)原發(fā)性高血壓患者73例。 (2)血壓正常的健

4、康體檢者86例。 2．α—AR細(xì)胞外三環(huán)抗原多肽的合成。 3．血清自身抗體水平的測定。 4．統(tǒng)計處理。 二．α1腎上腺素受體自身抗體致離體血管的收縮作用以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。 目的： 1．采用大血管環(huán)張力測定技術(shù)，觀察抗α1腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)抗體(α1—AA)對大鼠容量血管收縮功能的作用，分析該自身抗體對患者血壓的影響；采用微血管環(huán)技術(shù)，觀察α1—AA對主要臟器的小血管(包括冠

5、狀動脈、大腦中動脈和腎動脈)和外周阻力血管(腸系膜動脈)的直接作用，明確該自身抗體對患者主要臟器和外周阻力血管功能的影響； 2．采用血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)，觀察α1—AA對血管平滑肌細(xì)胞靜息鈣離子水平的影響，以明確該抗體致血管收縮的可能機制； 3．利用大血管環(huán)技術(shù)，觀察α1—AA對SHR和其天然對照WKY大鼠胸主動脈收縮作用的特點，以及內(nèi)皮細(xì)胞和NO在收縮作用的影響，明確高水平的α1—AA在原發(fā)性高血壓患者血清中存在

6、的意義，并試圖探索其可能機制； 4．采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察α1—AA對離體培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷效應(yīng)及其致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的途徑，闡明α1—AA在高血壓致血管損傷的可能性及其防治的意義。 方法： 1．α1—AA的純化和鑒定。 2．采用離體胸主動脈環(huán)張力測定技術(shù)檢測α1—AA對大血管收縮功能的影響。 3．采用為血管環(huán)張力測定技術(shù)觀察α1—AA對大鼠腎動脈、大腦中動脈、冠狀動脈和腸系膜動脈收縮功能的影響

7、； 4．大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，并利用免疫熒光細(xì)胞技術(shù)對其種類和純度進(jìn)行鑒定； 5．利用激光共聚焦顯微鏡以及Ca2+的熒光指示劑Fluo-3/AM觀察α1—AA對平滑肌細(xì)胞胞內(nèi)靜息鈣水平的影響，分組情況同2； 6．利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，觀察α1—AA對內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷作用，分組情況同2； 7．收集各處理組的內(nèi)皮細(xì)胞，采用Caspase-3、Caspase-8、Caspasc-9的活

8、性測定法檢測內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡發(fā)生情況； 8．采用LDH酶活性測定法觀察內(nèi)皮細(xì)胞的壞死程度； 9．采用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色法和單細(xì)胞凝膠電泳觀察培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率； 10．采用單細(xì)胞凝膠電泳觀察培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞DNA損傷程度。 三．抗α1腎上腺素受體自身抗體的長期作用下對血管結(jié)構(gòu)和功能的影響。 目的： 1．在體情況下，通過靜脈給藥的途徑觀察α1—AA對大鼠在體血壓的急性作用；

9、 2．使用人工合成的α1—AR—ECⅡ肽段免疫α1—AA陰性的正常大鼠，建立主動免疫動物模型，觀察該抗體的長期作用對在體血壓以及離體大鼠血管舒縮功能的影響；以及對內(nèi)皮細(xì)胞損傷情況及其可能的機制；闡明α1—AA參與高血壓致血管病理改變的可能性及其防治的意義。 方法： 1．選擇雄性Wistar大鼠(200-220g)，通過右側(cè)頸總動脈插管技術(shù)和靜脈給藥方式測定α1—AA對大鼠在體血壓急性作用。 2．將α1—AA陰

10、性、體重180-220g的健康Wistar雌性大鼠隨機分成兩組。 3．采用間接SA—ELISA(Streptavidin—ELISA)方法測定血清自身抗體的水平，檢測條件及結(jié)果判定方法同第一部分； 4．利用鼠尾動脈血壓儀定期觀察長期主動免疫對各組大鼠血壓的影響； 5．利用離體胸主動脈環(huán)張力測定技術(shù)檢測各組大鼠離體血管舒張和收縮反應(yīng)的變化； 6．采用定量ELISA試劑盒測定不同時間點大鼠血清中內(nèi)皮素-1的含

11、量，以反應(yīng)各組大鼠內(nèi)皮損傷情況和趨勢； 7．利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測各組大鼠胸主動脈iNOS的表達(dá)情況。 內(nèi)皮素統(tǒng)的分布最為集中，作用也尤為突出。那么，具有類激動劑樣作用的α1—AA是否也可以與血管平滑肌上的相應(yīng)受體(α1—AR)結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的收縮效應(yīng)呢?如果是，那么長期高水平的α1—AA是否象α1—AR激動劑那樣，也具有致血管病變的病理意義呢?已有的研究報道(包括前期工作)揭示了α1—AA對心臟和血管平滑肌的直接

12、、短期作用，如果能夠進(jìn)一步揭示α1—AA對各類血管(尤其是阻力血管)的直接作用，將會為深入認(rèn)識α1—AA在高血壓發(fā)生發(fā)展中的作用和機制，同時也為判斷不同人群血清中存在α1—AA的病理生理學(xué)意義提供科學(xué)的實驗依據(jù)。 α1—AR除分布在血管平滑肌外，還廣泛分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，后者在調(diào)節(jié)血管收縮和舒張功能中具有重要的作用。血液中的α1—AA在血管內(nèi)流動時，是否可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的α1—AR結(jié)合呢?如果可以，這種結(jié)合有可能產(chǎn)生什么樣的

13、作用呢?已知，過度的α1—AR激活會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。那么，具有類激動劑樣作用的α1—AA是否也有可能導(dǎo)致類似的損傷呢?眾所周知，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，會導(dǎo)致流經(jīng)損傷部位的血液中諸多血管活性物質(zhì)的聚集(如血小板、凝血因子等)進(jìn)而引發(fā)隨后的釋放反應(yīng)，從而導(dǎo)致動脈血管管壁一系列的病理改變，如粥樣硬化斑塊的形成。然而，導(dǎo)致這種血管內(nèi)皮細(xì)胞病理改變的機制尚不完全清楚。因此，如果能夠通過直接的實驗證據(jù)說明α1—AA有可能參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的損

14、傷將有助于認(rèn)識α1—AA在原發(fā)性高血壓發(fā)病過程中血管病變的機制。 綜上所述，設(shè)計了本研究課題： (1)采用ELISA方法，篩查原發(fā)性高血壓患者和血壓正常人群血清中針對α1—AR三個細(xì)胞外環(huán)抗肽抗體的分布情況，并分別分析這三種抗體水平和患者血壓的相關(guān)性，以初步推測該三種自身抗體可能的臨床意義。 (2)通過上述實驗，尋找出與患者血壓相關(guān)的抗體類型，并通過離體實驗技術(shù)，觀察這些自身抗體對正?；蚋哐獕捍笫蟮拇笱芎臀⒀?/p>

15、功能的直接作用及其可能的機制。 (3)以在體動脈血壓為切入點，用急性或慢性動物模型的方法，觀察該類抗體對大鼠血壓的直接或長期影響；通過血管環(huán)張力測定技術(shù)，觀察在體情況下α1—AA的長期作用對大鼠血管收縮和舒張活動的影響；以血清中內(nèi)皮素含量為指標(biāo)，觀察在該類抗體長期存在下對在體血管內(nèi)皮的損傷作用(另題研究該類抗體長期作用對血管平滑肌細(xì)胞的功能和形態(tài)學(xué)影響)，以期闡明α1—AA在高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中參與了致血管結(jié)構(gòu)和功能損傷的可能

16、性及其防治的意義。 本課題擬驗證的假說：原發(fā)性高血壓患者血清中存在的α1—AA，有可能通過影響血管結(jié)構(gòu)和功能而與高血壓發(fā)生發(fā)展相關(guān)： (1)在原發(fā)性高血壓患者血清中的α1—AA與患者的血壓呈一定的相關(guān)性； (2)在離體情況下，α1—AA對大血管具有直接的收縮效應(yīng)，但對不同重要的組織器官小阻力血管可能表現(xiàn)各不相同；SHR大血管對α1—AA的敏感性可能有所改變，其機制可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞受損和NO的生物利用度改變有關(guān)；