RecQ解旋酶分子特性的研究.pdf

1、Waston和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)后，不僅引導(dǎo)人們發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，它作用于DNA以一條鏈為模板聚合形成一條新的DNA鏈；而且也讓科學(xué)家們尋找到一種酶能夠在DNA復(fù)制時破壞互補(bǔ)堿基對的氫鍵結(jié)構(gòu)而打開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。隨后，相似功能的酶在RNA復(fù)制中也被發(fā)現(xiàn)。這類酶被科學(xué)家稱為解旋酶。解旋酶是一類能解開核苷酸雙鏈的酶，它廣泛存在于從病毒到人類等多種生物體中。自1976年人類在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了第一個解旋酶，至今已有上百種解旋酶被

2、發(fā)現(xiàn)，而且這一酶家族成員還在不斷擴(kuò)大。
　　 解旋酶廣泛存在于多種生物體中，有些生物還同時具有多種不同類型的解旋酶。盡管解旋酶種類繁多，人們在研究過程中發(fā)現(xiàn)，這類蛋白酶在其氨基酸序列上有一定的同源性和相似性。分析表明，這些同源序列在進(jìn)化過程中構(gòu)成了幾個高度保守的區(qū)域，這些區(qū)域執(zhí)行不同的酶功能。人們根據(jù)酶的二維結(jié)構(gòu)和一級序列，把解旋酶分為幾大家族來分類研究。經(jīng)過多年的研究，人們發(fā)現(xiàn)解旋酶具有多種功能，在細(xì)胞內(nèi)它們參與DNA復(fù)制、修

3、復(fù)、轉(zhuǎn)錄重組以及RNA接拼、核糖體組裝、蛋白質(zhì)翻譯，端粒穩(wěn)定。最近，還發(fā)現(xiàn)個別解旋酶甚至參與機(jī)體天然免疫反應(yīng)機(jī)制。解旋酶已不僅僅只是分開核酸雙鏈結(jié)構(gòu)的一類酶，它的生物功能遠(yuǎn)不止此。
　　 解旋酶第二大家族中的RecQ解旋酶亞家族在核酸代謝過程中起了關(guān)鍵的作用，這一家族參與DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、重組、轉(zhuǎn)錄甚至端粒穩(wěn)定機(jī)制。人們發(fā)現(xiàn)在人體中存在RECQ1、BLM、WRN、RECQ4和RECQ5這五種RecQ解旋酶家族成員。其中，B

4、LM、WRN、RECQ4編碼基因缺陷會導(dǎo)致人類相應(yīng)的疾病發(fā)生，它們分別為Bloom綜合癥(BS)、Werner綜合癥(WS)、Rothmund-Thomson綜合癥(RTS)、RAPADILINO綜合癥和Baller-Gerold綜合癥。這些疾病雖然在人類中都是極其罕見的隱形遺傳疾病，但是在分子水平都表現(xiàn)為基因組高度不穩(wěn)定性、染色體異常(染色體斷裂、缺失、重排、姐妹染色體交換等)和對DNA損傷因子敏感性增加。在臨床上表現(xiàn)為過早衰老、II

5、型糖尿病、骨質(zhì)疏松、動脈硬化和極度容易發(fā)生癌癥。大部分病人都是最終發(fā)生不同癌癥而死亡。這一臨床共同現(xiàn)象引起了人們的關(guān)注和研究熱潮。對解旋酶的結(jié)構(gòu)功能、作用機(jī)制的研究不僅可以認(rèn)清核酸代謝過程，還能幫助我們揭示癌癥發(fā)病的某些相關(guān)機(jī)理。同時了解病毒解旋酶的結(jié)構(gòu)與功能，為抗病毒藥物的研制提供了新的靶點和思路。
　　 解旋酶具有四大基本生物化學(xué)活性：NTP水解活性、DNA或RNA結(jié)合活性、核酸鏈解鏈活性和核酸鏈退火配對活性。在二價金屬離子

6、和NTP的存在下，解旋酶便表現(xiàn)出水解NTP的性質(zhì)，大部分酶水解ATP和dATP，一些酶則能水解其他的核苷酸，比如TTP和GTP。當(dāng)解旋酶與DNA或RNA結(jié)合后，利用水解核苷酸產(chǎn)生的能量，推動酶在核酸鏈上的移動，從而解開互補(bǔ)的兩條核酸鏈。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)有些解旋酶在核酸修復(fù)過程中能促使核酸鏈配對重組。這使得我們意識到解旋酶在基因穩(wěn)定過程中的作用越來越重要。但是并不是所有的解旋酶成員都表現(xiàn)出這四種基本生化功能，這與酶自身的結(jié)構(gòu)有密切

7、的關(guān)系，酶的結(jié)構(gòu)決定了它所能表現(xiàn)的作用機(jī)制和生化活性。長期以來，科學(xué)家們一直研究探索解旋酶的結(jié)構(gòu)與其功能間的相互關(guān)系，力求發(fā)現(xiàn)解旋酶本質(zhì)的運作機(jī)制。
　　 RecQ解旋酶家族盡管蛋白種類繁多，在氨基酸序列上同源性不高，但有限的同源序列構(gòu)成了數(shù)個典型的功能區(qū)域：從N端向C端方向，分別為位于氨基酸序列中間段的解旋酶核心區(qū)域，RecQ C端區(qū)域和解旋酶RNase D保守區(qū)域，這些區(qū)域具有不同的功能，并相互協(xié)調(diào)共同執(zhí)行解旋酶的運作機(jī)制。

8、解旋酶核心區(qū)域是解旋酶標(biāo)志性結(jié)構(gòu)，它由一段高度保守的氨基酸序列組成，含有7個保守區(qū)域，負(fù)責(zé)結(jié)合NTP、NIP水解和DNA結(jié)合。RecQ-Ct區(qū)域是RecQ解旋酶家族唯一含有的結(jié)構(gòu)特征，但不是所有RecQ成員都含有這一結(jié)構(gòu)域。RecQ-Ct區(qū)域包含兩個重要的亞結(jié)構(gòu)域：由四個α螺旋和四個保守的半胱氨酸殘基組成的結(jié)構(gòu)平臺，因能特異結(jié)合鋅離子而被命名為鋅結(jié)合區(qū)域或鋅指結(jié)構(gòu)；序列上不太保守的翼型螺旋亞結(jié)構(gòu)域。目前發(fā)現(xiàn)RecQ-Ct結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)酶

9、與核酸的結(jié)合、酶自身的折疊作用。HRDC區(qū)域位于解旋酶氨基酸序列的C端，在部分RecQ成員中缺失，對這一結(jié)構(gòu)域的認(rèn)識甚淺，一些研究表明HRDC區(qū)域能夠增強(qiáng)解旋酶對NTP水解和解鏈活性。雖然解旋酶不同的結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)不同的酶功能，但解旋酶核心區(qū)域、RecQ-Ct和HRDC區(qū)域并不是各自獨立的，它們互相之間相互作用相互協(xié)調(diào)，共同完成酶的生理作用機(jī)制。
　　 本文就以RecQ解旋酶家族中BLM、RECQ5和枯草桿菌RecQ(Bacillu

10、s subtilisRecQ)為實驗對象，來研究解旋酶不同結(jié)構(gòu)域之間是如何相互影響、相互牽制。從而了解解旋酶結(jié)構(gòu)與其功能相互間的關(guān)系，揭示解旋酶的作用機(jī)制。
　　 首先我們把焦點放在RecQ解旋酶的RecQ-Ct區(qū)域，想了解這一區(qū)域是如何與解旋酶核心區(qū)域相互作用，相互之間存在何種聯(lián)系，來共同維持解旋酶整體的酶活性平衡。我們以RECQ5為研究模型，RECQ5是人體5種解旋酶之一，雖然至今未發(fā)現(xiàn)它與任何人類疾病有關(guān)，但是有實驗證明R

11、ECQ5與BLM蛋白密切相關(guān)，能協(xié)助BLM蛋白維持染色體的平衡。而且RECQ5解旋酶天然存在三種異構(gòu)體：RECQ5α、REQ5β和RECQ5γ。其中REQ5β最大，含有解旋酶核心區(qū)域和RecQ-Ct區(qū)域，相對的RECQ5α最小，只含有解旋酶核心區(qū)域結(jié)構(gòu)。這兩種異構(gòu)體成為研究RecQ-Ct結(jié)構(gòu)域功能，和解旋酶核心結(jié)構(gòu)域相互關(guān)系最理想的天然模型。實驗結(jié)果揭示，RECQ5α既沒有ATP水解能力，也不表現(xiàn)解鏈活性，卻展示出對互補(bǔ)核酸鏈的退火配對

12、作用。REQ5β則表現(xiàn)出較弱的退火配對能力和較強(qiáng)的解鏈活性。一系列實驗證明，其中RecQ-Ct區(qū)域的保守結(jié)構(gòu)一鋅結(jié)合區(qū)域起到了重要作用，不僅增加酶對DNA的結(jié)合能力，而且起到了分子開關(guān)的作用，能夠通過對DNA結(jié)合的增強(qiáng)來抑制解旋酶核心區(qū)域的退火配對活性，同時改變蛋白構(gòu)型啟動解鏈過程。我們率先提出RecQ-Ct區(qū)域鋅指結(jié)構(gòu)與解旋酶核心區(qū)域相互作用的機(jī)制模型，初步揭示兩者之間的相互聯(lián)系，了解RecQ解旋酶結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)之間，結(jié)構(gòu)與功能間的相互關(guān)

13、系。
　　 在對RecQ解旋酶核心區(qū)域與RecQ-Ct區(qū)域認(rèn)識的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究位于氨基酸序列最C端的HRDC區(qū)域的功能，探究HRDC與解旋酶核心區(qū)域、RecQ-Ct區(qū)域的相互關(guān)系。本文利用RecQ解旋酶家族中枯草桿菌RecQ(Bacillus subtilis RecQ，SubRecQ)亞家族為研究模型，它由兩個成員組成。這兩種RecQ解旋酶的典型結(jié)構(gòu)差異在于一個含有HRDC區(qū)域，而另一個則HRDC區(qū)域缺失。為研究提供了理想

14、的天然結(jié)構(gòu)模型。結(jié)果表明，具有HRDC區(qū)域的SubRecQ酶，表現(xiàn)出解旋酶基本的生化活性，并能有效地解開一些DNA復(fù)制與修復(fù)中DNA錯誤結(jié)構(gòu)甚至是Holliday結(jié)構(gòu)。相對地，SubRecQ如果缺失HRDC區(qū)域，雖能具有較弱ATP水解活性，解鏈活性，但無法解開某些復(fù)雜的DNA復(fù)制與修復(fù)中間體結(jié)構(gòu)，同時也不具有解開Holliday結(jié)構(gòu)的能力。兩種解旋酶的DNA結(jié)合活性與DNA退火配對活性無明顯差異。分析認(rèn)為，HRDC結(jié)構(gòu)能輔助增強(qiáng)解旋酶的

15、ATP水解活性與解鏈活性，在解開復(fù)雜的DNA結(jié)構(gòu)過程中起到了關(guān)鍵的作用。
　　 RecQ解旋酶家族中的BLM蛋白是迄今在人體中發(fā)現(xiàn)的5種解旋酶之一，BLM編碼基因的缺陷會導(dǎo)致疾病Bloom綜合癥的發(fā)生。而且BLM蛋白具有RecQ解旋酶家族典型的結(jié)構(gòu)特征，因此它成為理想的研究模型。本實驗室致力于BLM蛋白生化活性的研究已有多年，發(fā)現(xiàn)完整的BLM蛋白能表現(xiàn)出解旋酶全部的基本生物功能，也了解了其各個結(jié)構(gòu)區(qū)域負(fù)責(zé)哪些酶功能。在研究其結(jié)構(gòu)

16、與功能的相互關(guān)系的過程中我們發(fā)現(xiàn)，BLM蛋白的解旋酶核心區(qū)域含有高度保守的精氨酸殘基靠近于與其結(jié)合的AIPγ磷酸位置，稱為精氨酸指結(jié)構(gòu)。我們推測這一結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)ATP的結(jié)合與水解活性。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，BLM蛋白解旋酶核心區(qū)域還有兩個保守的精氨酸殘基-R979與R982。突變這兩個殘基位點后，發(fā)現(xiàn)BLM對ATP的水解能力明顯下降，同時喪失解鏈能力，但對ATP結(jié)合與DNA結(jié)合能力并無影響。R982突變體的ATP水解和解鏈活性減弱幅度比R979

17、突變體更為明顯。運用目前公認(rèn)的精氨酸指檢測試劑一原釩酸鹽(Vi)探測BLM蛋白的精氨酸指結(jié)構(gòu)，Vi能與鎂離子、ADP和酶形成復(fù)合物，從而抑制酶對核苷酸5’端三磷酸催化活性，試驗結(jié)果表明Vi能非競爭性抑制R982精氨酸殘基對ATP的水解作用，對R979精氨酸無抑制作用，從而確定BLM蛋白R982氨基酸殘基形成了精氨酸指結(jié)構(gòu)。我們還發(fā)現(xiàn)R982精氨酸指能與其周圍其他一些解旋酶核心區(qū)域的重要殘基相互作用，促進(jìn)對ATP的招募和水解。在此我們也從

18、一個新的角度揭示解旋酶是如何與ATP和核酸結(jié)合啟動ATP的水解，隨后引起蛋白構(gòu)型變化并將水解產(chǎn)生的化學(xué)能源用于解鏈過程的作用機(jī)制。
　　 解旋酶的結(jié)構(gòu)是其生化活性的前提，不同保守功能區(qū)域分別具有不同的功能，彼此之間相互作用，互相協(xié)調(diào)，來完成酶的整個運作機(jī)制。除了解旋酶核心區(qū)域外，RecQ-Ct與HRDC區(qū)域也是解旋酶重要的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的缺失與突變會不同程度影響酶的功能，增加或者減弱某些酶活性。解旋酶結(jié)構(gòu)特征的完整保證了其在細(xì)胞中維