人MBL在哺乳細(xì)胞中表達(dá)的研究.pdf

1、MBL由肝細(xì)胞合成并分泌入血,但人血漿中MBL含量極低(~1mg/L),這使得科研和臨床應(yīng)用MBL不但花費(fèi)高昂而且不可能大規(guī)模制備.體外大量制備MBL,將為MBL分子的結(jié)構(gòu)-功能以及MBL基因點(diǎn)突變引起調(diào)理吞噬缺損機(jī)制等研究提供條件.一、目的1.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人MBL基因,獲得重組人MBL蛋白.2.比較重組表達(dá)載體PcDNA4/HisC-MBL和PcDNA3.1<'+>-MBL在哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO、HEPG2和HEK293中的表達(dá)

2、情況.二、方法1.應(yīng)用PCR從含有中國(guó)人野生型MBL cDNA的質(zhì)粒pGEM-MBL中擴(kuò)增目的基因片段,將其克隆至真核表達(dá)載體PcDNA4/HisC、PcDNA3.1<'+>,酶切及測(cè)序鑒定.以電穿孔法將重組載體PcDNA4/HisC-MBL轉(zhuǎn)染CHO、HEPG2細(xì)胞,將重組載體PcDNA3.1<'+>-MBL轉(zhuǎn)染CHO、HEPG2和HEK293細(xì)胞,Zeocin和G418選擇轉(zhuǎn)染子并克隆化培養(yǎng),以RT-PCR分析mRNA表達(dá).2.取P

3、cDNA4/HisC-MBL轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清,通過(guò)Ni-NTA agarose柱層析純化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western-blot和ELISA鑒定后,將其免疫小鼠,取鼠抗血清、鼠抗重組CRD血清和甘露聚糖進(jìn)行ELISA,分析目的蛋白的免疫學(xué)和生物學(xué)活性.3.以RT-PCR和ELISA對(duì)比分析重組表達(dá)載體PcDNA4/HisC-MBL和PcDNA3.1<'+>-MBL在不同細(xì)胞中MBL mRNA和蛋白表達(dá)情況.四、結(jié)論