人MBL在哺乳細胞中表達的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、MBL由肝細胞合成并分泌入血,但人血漿中MBL含量極低(~1mg/L),這使得科研和臨床應用MBL不但花費高昂而且不可能大規(guī)模制備.體外大量制備MBL,將為MBL分子的結(jié)構(gòu)-功能以及MBL基因點突變引起調(diào)理吞噬缺損機制等研究提供條件.一、目的1.在哺乳動物細胞中表達人MBL基因,獲得重組人MBL蛋白.2.比較重組表達載體PcDNA4/HisC-MBL和PcDNA3.1<'+>-MBL在哺乳動物細胞CHO、HEPG2和HEK293中的表達

2、情況.二、方法1.應用PCR從含有中國人野生型MBL cDNA的質(zhì)粒pGEM-MBL中擴增目的基因片段,將其克隆至真核表達載體PcDNA4/HisC、PcDNA3.1<'+>,酶切及測序鑒定.以電穿孔法將重組載體PcDNA4/HisC-MBL轉(zhuǎn)染CHO、HEPG2細胞,將重組載體PcDNA3.1<'+>-MBL轉(zhuǎn)染CHO、HEPG2和HEK293細胞,Zeocin和G418選擇轉(zhuǎn)染子并克隆化培養(yǎng),以RT-PCR分析mRNA表達.2.取P

3、cDNA4/HisC-MBL轉(zhuǎn)染的CHO細胞培養(yǎng)上清,通過Ni-NTA agarose柱層析純化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western-blot和ELISA鑒定后,將其免疫小鼠,取鼠抗血清、鼠抗重組CRD血清和甘露聚糖進行ELISA,分析目的蛋白的免疫學和生物學活性.3.以RT-PCR和ELISA對比分析重組表達載體PcDNA4/HisC-MBL和PcDNA3.1<'+>-MBL在不同細胞中MBL mRNA和蛋白表達情況.四、結(jié)論

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