hsp在不同細(xì)胞中表達(dá)差異檢測

1、凋亡相關(guān)基因－Bax在不同細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物差異檢測,實驗（三） 細(xì)胞損傷與保護(hù)3,原 理,免疫細(xì)胞化學(xué)（免疫組化）是將抗原、抗體間的免疫反應(yīng)引入細(xì)胞標(biāo)本，并通過對其所帶有的特殊標(biāo)記物的顯示，籍以對細(xì)胞內(nèi)某抗原或抗體作定性、定位以及定量檢測。 親和組織化學(xué)：則將一些具有雙價或多價結(jié)合力的物質(zhì)(生物素)，應(yīng)用于免疫組化，使得抗原抗體的親和力比免疫組化高出100萬倍。其更具高靈敏性和高特異性。

2、,原 理,Bax——凋亡相關(guān)基因Bcl-2家族成員細(xì)胞損傷時其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變（寡聚化）作用線粒體膜，使其膜通透性增加，釋放Cytc，細(xì)胞凋亡,原 理,本次實驗以Bax構(gòu)象蛋白為抗原，用小鼠特異性抗體（一抗）與其結(jié)合，再用生物素標(biāo)記的羊抗小鼠抗體（二抗）與前者結(jié)合，形成了生物素復(fù)合物。 此復(fù)合物與SABC作用，使得檢測物被放大，最后在顯色劑DAB的作用下，Bax構(gòu)象蛋白顯色（褐色）。,器材與試劑,儀器

3、：移液槍、槍頭、滴管、顯微鏡 材料：培養(yǎng)細(xì)胞 試劑：甲醇、PBS、封閉液、一 抗、 二抗、 SABC、DAB 、0.3％H2O2-PBS、,試 劑 說 明,PBS： 磷酸鹽緩沖液（ 0.01M pH7.4 ） 封閉液： 山羊血清(或BSA)，用時PBS稀釋 一 抗： 小鼠IgG，用時PBS稀釋 二抗： 生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG0.3％ H2O2-PBS（甲醇）

4、 消除內(nèi)源性過氧化物酶活性作用 SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 鏈酶親和素 ——生物素——過氧化物酶復(fù)合物) ： 抗生物素，起到放大作用 DAB(diaminobenzidine)顯色液： 3,3´-二氨基聯(lián)苯胺,實驗步驟,培養(yǎng)細(xì)胞（96孔板，每組3正常、3損傷、3損傷恢復(fù)）

5、PBS 洗3次 (輕輕地?fù)u動洗滌)甲醇固定10minPBS 洗3次 (輕輕地洗滌)加入封閉液（1:10） 25µl，37 ℃，30min以上加一抗（1:300）25µl，37℃，1h以上 (或4℃過夜)PBS 洗3次 (輕輕地?fù)u動洗滌)加二抗（1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10µl）25µl，37 ℃，1h以上PBS 洗3次 (輕輕地?fù)u動洗滌),實驗步驟,加0.3％ H

6、2O2-PBS/甲醇，37 ℃，30minPBS 洗3次 (輕輕地?fù)u動洗滌)SABC工作液（1ml PBS加入SABC 10µl，混勻）20-30µl，37 ℃，30分鐘PBS 洗3次 (輕輕地?fù)u動洗滌)DAB顯色： DAB顯色工作液配制（現(xiàn)配）：1ml蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各50ul，混勻后加至細(xì)胞孔板，鏡下控制，以蒸餾水終止反應(yīng)。觀察結(jié)果,實驗結(jié)果,,缺糖前 Hela 細(xì)胞,,,缺糖 2

7、4h Hela細(xì)胞,,,缺糖 48h Hela 細(xì)胞,,,缺糖前 PC 12細(xì)胞,,,缺糖 24 h PC 12細(xì)胞,,,,缺糖 48 h PC 12細(xì)胞,注意事項,一、二抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。染色背景過高，在DAB顯色之前，用含0.01-0.02％TWEEN20的PBS洗滌標(biāo)本4次，再PBS洗2次，然后DAB顯色。 DAB有毒性（小心）SABC試劑盒保存在4 ℃為佳(2年)，而-20 ℃短期內(nèi)生物活