MYCN在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)及其作用的研究.pdf

1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)是兒童最常見(jiàn)的惡性實(shí)體腫瘤之一，占兒童腫瘤死亡人數(shù)的15％，其惡性程度高，可早期轉(zhuǎn)移至骨髓、骨組織，預(yù)后較差，故深入研究NB的發(fā)生、發(fā)展機(jī)理至關(guān)重要。
　　MYCN是MYC家族成員，可編碼核蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移中有重要作用。約25％～30％的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒 MYCN基因呈高表達(dá)，與低生存率，腫瘤復(fù)發(fā)，預(yù)后差及對(duì)化療藥物敏感性降低等相關(guān)。因而深入了解MYCN在神經(jīng)母細(xì)胞

2、瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療產(chǎn)生積極的影響。
　　本課題共分兩個(gè)部分：（1）熊果酸對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖凋亡及MYCN表達(dá)的影響；（2）MYCN與OPN在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)的相關(guān)性研究。
　　第一部分熊果酸對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖凋亡及MYCN表達(dá)的影響
　　目的：神經(jīng)母細(xì)胞瘤是位居第二的兒童惡性實(shí)體腫瘤，已發(fā)現(xiàn)MYCN基因的高表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)。研究顯示熊果酸作為中成藥對(duì)多種腫瘤有治療作用，但對(duì)兒童神經(jīng)母

3、細(xì)胞瘤是否有影響尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用熊果酸作用于體外培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY-5Y)，觀察熊果酸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及MYCN基因mRNA表達(dá)的影響。
　　方法：以終濃度為4uM/L、8uM/L、12uM/L的熊果酸作用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY-5Y，WST-1法檢測(cè)SH-SY-5Y細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SH-SY-5Y細(xì)胞凋亡情況，采用Real time PCR方法檢測(cè)MYCN mRNA的表達(dá)情況。

4、>　　結(jié)果：熊果酸對(duì)SHSY-5Y細(xì)胞增殖的抑制呈明顯的劑量、時(shí)間依賴性，隨劑量的增加，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果逐漸加強(qiáng)；熊果酸對(duì)SH-SY-5Y細(xì)胞凋亡的促進(jìn)呈明顯的劑量依賴性，隨劑量的增加，促進(jìn)凋亡效果逐漸加強(qiáng)；熊果酸對(duì)SHSY-5Y細(xì)胞MYCN表達(dá)有抑制作用并有明顯的劑量依賴性，隨劑量的增加，抑制效果逐漸加強(qiáng)。12uM/L作用72 h后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖抑制效率達(dá)98.3%，MYCN基因mRNA表達(dá)抑制率達(dá)52.37％。

5、　　結(jié)論：應(yīng)用熊果酸在體外環(huán)境作用SH-SY-5Y細(xì)胞，可以有效抑制該細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制原癌基因MYCN mRNA的表達(dá)。
　　第二部分 MYCN與OPN在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)的相關(guān)性研究
　　目的：神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童常見(jiàn)的惡性實(shí)體腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)MYCN在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)。也有報(bào)道OPN在多種腫瘤中具有促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用，在兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤中也呈高表達(dá)，但MYCN與OPN是否有相關(guān)性尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)

6、用 siRNA抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-BE(2))MYCN的表達(dá)，觀察 NB細(xì)胞OPN mRNA及蛋白的表達(dá)變化情況，以了解MYCN與OPN在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中是否有相關(guān)性。
　　方法：在四株MYCN表達(dá)程度不同的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（SK-N-BE(2)、IMR-32、SH-SY-5Y、SK-N-SH)間比較MYCN及OPN mRNA及蛋白表達(dá)情況；應(yīng)用siRNA抑制MYCN表達(dá)量最高的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞MYCN的表達(dá)

7、后，采用Real time PCR及western blot法檢測(cè)MYCN及OPN mRNA及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：四株神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中 MYCN表達(dá)高者 OPN表達(dá)亦高，其中SK-N-BE(2)細(xì)胞株的MYCN及OPN的表達(dá)量高于其他細(xì)胞株；Real time PCR結(jié)果顯示，siRNA對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-BE(2))MYCN mRNA抑制率為48.05%，OPN的 mRNA表達(dá)同時(shí)降低46.39%。western