蘿卜硝酸鹽的代謝生理與相關(guān)基因分離鑒定.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus L.)是一種重要十字花科根菜類蔬菜作物，原產(chǎn)于中國，具有較高的食用和藥用價值。硝酸鹽(NO3-)是作物可以直接利用的重要氮源之一，而硝酸鹽是強致癌物亞硝胺的前提，過量攝入會誘發(fā)消化器官的癌變，嚴(yán)重威脅人類的健康，尤其對于喜硝態(tài)氮的根菜類作物蘿卜，是人們攝入硝酸鹽的主要來源，目前國內(nèi)關(guān)于蘿卜硝酸鹽代謝途徑中的關(guān)鍵基因分離鑒定研究鮮有報道，極大限制了硝酸鹽累積性狀的遺傳改良。因此通過育種的手段篩選出低

2、硝酸鹽含量的蘿卜品種，降低蘿卜硝酸鹽的含量達(dá)到人體健康許可的范圍，成為蘿卜育種的重要目標(biāo)之一，具有極其重要的實踐意義。鑒于此，本文在分析不同蘿卜品種硝酸鹽累積量差異基礎(chǔ)上，分析不同氮素水平對蘿卜根冠比、硝酸鹽含量及硝酸還原酶活性的影響;分離克隆硝酸鹽代謝途徑中關(guān)鍵基因及其啟動子序列;分析不同氮素處理下硝酸鹽同化過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)特性;并對硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)行不同品種之間的硝酸鹽含量和硝酸還原酶活性的比較，以及不同NO3-處理濃度下轉(zhuǎn)運蛋

3、白家族成員的表達(dá)特性分析，主要研究結(jié)果如下:
　　1.不同氮素水平對蘿卜根冠比、硝酸鹽含量及硝酸還原酶活性的影響
　　比較分析了15種基因型蘿卜材料葉及根的硝酸鹽含量的差異，篩選出高硝酸鹽含量的品種‘NAU-DHP’，中等硝酸鹽含量的品種‘NAU-QTSH’，低硝酸鹽含量的品種‘NAU-XHT’。以中等硝酸鹽含量的蘿卜品種‘NAU-QTSH’作為供試材料，采用無土栽培，進(jìn)行兩種處理:不同濃度的NO3--N0、5、20、30和

4、50 mmol·L-1處理24 h;不同處理時間0、4、8、12和24 h，NO3--N濃度30 mmol·L-1。分別研究這兩種處理對植株根冠比、硝酸鹽含量及硝酸還原酶活性的影響，為蘿卜生產(chǎn)及施肥提供理論依據(jù)。結(jié)果表明:根冠比隨著處理濃度增加而增加，在30 mmol·L-1時達(dá)到最大值，然后逐漸降低;而隨著處理時間的延長，根冠比也隨之增加。葉和根的硝酸鹽含量隨著處理濃度增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，而隨著處理時間的增加硝酸鹽含量也隨之增

5、加，但是葉吸收NO3-比根吸收慢，且根的含量比葉高。隨著處理濃度增加，葉和根的硝酸還原酶活性均在5 mmol·L-1處達(dá)到最小值，然后升高至30 mmol·L-1隨后下降，而隨時間延長，葉的硝酸還原酶活性在8h達(dá)到最大，然后迅速下降，而根在4h達(dá)到最大，然后逐漸下降，且葉的活性比根高。
　　2.硝酸鹽代謝途徑中的關(guān)鍵基因克隆、啟動子克隆及載體構(gòu)建
　　以中等硝酸鹽蘿卜品種‘NAU-QTSH’為試驗材料，采用同源克隆法，從蘿卜

6、葉片中分離得到RsNiR和RsGS2基因組DNA和cDNA全長以及RsNR、RsGDH1和RsGDH2的cDNA全長。其中，RsNiR DNA全長為1936bp，包括1524bp的開放閱讀框，編碼507個氨基酸;RsGS2 DNA全長為2190bp，包括1287bp的開放閱讀框，編碼428個氨基酸;RsNR包括2742bp的開放閱讀框，編碼913個氨基酸;RsGDH1包括1236bp的開放閱讀框，編碼411個氨基酸;RsGDH2包括12

7、75bp的開放閱讀框，編碼424個氨基酸。運用染色體步移法克隆了RsNR、RsNiR、RsGS2基因的啟動子序列，分別為343bp，843bp，912bp，用PLACE、PlantCARE在線預(yù)測工具分析表明:序列含有典型的啟動子的特定結(jié)構(gòu)，并含有眾多的順式作用元件和一些其它的調(diào)控序列，說明蘿卜RsNR、RsNiR、RsGS2基因的表達(dá)可能受MYB、光、熱響應(yīng)及其他元件的調(diào)控，為進(jìn)一步研究這些基因的功能和表達(dá)特征分析提供理論基礎(chǔ)。同時對

8、基因RsNiR、RsGS2基因進(jìn)行了表達(dá)載體的構(gòu)建，為蘿卜硝酸鹽轉(zhuǎn)基因提供了依據(jù)。
　　3.硝酸鹽同化過程中關(guān)鍵基因表達(dá)特性分析
　　以蘿卜品種‘NAU-QTSH’為實驗材料，分別進(jìn)行NO3-N0、5、20、30和50 mmol·L-1處理24 h和30 mmol·L-1 NO3--N處理0、4、8、12和24 h兩種處理，研究分析了蘿卜不同組織部位中硝酸鹽合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因的表達(dá)特性。結(jié)果表明:RsNR基因在葉片、根

9、和須根中表達(dá)較高，而在葉柄和莖中幾乎不表達(dá)，且葉和根在30mmol·L-1濃度時達(dá)到最大，須根在20 mmol·L-1時達(dá)到最大，葉和根在處理4h時達(dá)到最大、葉柄和莖在處理12h達(dá)到最大;RsNiR基因主要在葉和根中表達(dá)，在葉柄、莖和須根中表達(dá)量較低;RsGS2基因表達(dá)在葉中30 mmol·L-1處達(dá)到最大，根在20mmol·L-1處達(dá)到最大，且根在處理24 h時達(dá)到最大，須根則在處理4h時達(dá)到最大;RsGDH1根在處理濃度為5 mmo

10、l·L-1時表達(dá)量達(dá)到最大，根在處理12h時達(dá)到最大;RsGDH2基因在須根處理50 mmol·L-1時達(dá)到最大，根在處理12h時達(dá)到最大;GLN基因家族的基因在根中的表達(dá)量最高。本研究基于關(guān)鍵基因的表達(dá)特性，揭示了蘿卜硝酸鹽代謝過程的分子機制，為篩選出低硝酸鹽蘿卜品種提供依據(jù)。
　　4.蘿卜硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族基因表達(dá)特性分析
　　以蘿卜(Raphanus sativus L.)高硝酸鹽含量品種‘NAU-DHP’和低硝酸鹽含

11、量品種‘NAU-XHT’為供試材料，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，測定了0、5 mmol·L-1和50 mmol·L-1NO3--N處理24 h后硝酸鹽含量及硝酸還原酶活性，并應(yīng)用qRT-PCR方法對NRT1和NRT2基因家族中的關(guān)鍵基因進(jìn)行了不同組織在不同處理下的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:不同基因型的蘿卜硝酸鹽積累量在高濃度下表現(xiàn)的更加明顯，DHP的轉(zhuǎn)運硝酸根的能力要比XHT強，且更容易從環(huán)境中吸收硝酸根離子。DHP的NRA明顯高于XHT，