非酒精性脂肪性肝病機制及標志物的蛋白質組學研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliver—disease，NAFLD)已經(jīng)成為一種常見的慢性肝病，其發(fā)病率逐年上升。它包括單純性脂肪肝(simplesteatosis，SS)、脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)、肝纖維化和肝硬化。脂肪肝是一種良性疾病，而NASH卻可進一步發(fā)展、惡化成為終末期肝病，嚴重者可導致死亡。目前NAFLD的發(fā)生發(fā)展機制至今仍尚不清楚，認為與氧化應

2、激的增加、線粒體損傷和脂肪因子等因素相關，但對導致進行性肝細胞損傷的機制有待于進一步探討。蛋白質組學是一門研究機體特定條件下功能狀態(tài)的前沿技術，更貼近機體已經(jīng)或正在發(fā)生的行為和功能狀態(tài)，可為疾病診斷和治療提供大量的理論和實驗依據(jù)。同時，肝活檢是一種損傷性的檢測方法，而且取得的肝組織樣本也不足于大規(guī)模的篩選差異蛋白質。因此，本研究以蛋氨酸和膽堿缺乏(methionineandcholinedeficient，MCD)飲食誘導的NAFLD小

3、鼠模型為研究對象，采用差異凝膠電泳(dimensionaldifferencegelelectrophoresis，DIGE)技術篩選出與NAFLD密切相關的肝臟差異蛋白質譜，結合生物信息學手段系統(tǒng)的分析了差異蛋白的功能和調(diào)控網(wǎng)絡，并篩選出重要的節(jié)點分子進行了驗證，從而為深入探討NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定了基礎。同時本研究還采用血清蛋白質組學分析(serologicalproteomeanalysis，SERPA)技術篩選出與NA

4、FLD密切相關的自身抗原譜，為挖掘NAFLD潛在的血清標志物而提供了理論依據(jù)。 我們分別用正常飲食與MCD飲食飼養(yǎng)小鼠，并在MCD飼養(yǎng)后的2、5、8周，成功復制出不同病變程度的NAFLD動物模型(單純性脂肪肝(SS)，脂肪性肝炎(NASH)及NASH伴早期肝纖維化。我們采用DIGE技術分析了不同造模時間的正常組和模型組小鼠肝臟蛋白質表達譜的差異，并用MALDI—TOF/TOF質譜儀進行差異蛋白質的檢測，共鑒定了189個差異蛋白。

5、其中SS階段的差異蛋白58個，NASH階段的差異蛋白82個，NASH伴早期肝纖維化階段的差異蛋白162個。這些差異蛋白多數(shù)存在于線粒體(52.2％)，其次為細胞外區(qū)域(13.4％)、內(nèi)質網(wǎng)(10.4％)、細胞漿(9.0％)、細胞核(9.0％)、過氧化物酶體(4.5％)和未知定位(1.5％)。通過差異蛋白的功能和調(diào)控網(wǎng)絡分析，我們發(fā)現(xiàn)隨著NAFLD病程的進展，參與清除氧自由基相關酶、脂肪酸β氧化的相關酶及糖異生相關酶的表達逐漸降低，而脂肪

6、形成相關酶和細胞骨架蛋白的表達逐漸升高。同時，在NASH伴早期肝纖維化階段，星狀細胞標志蛋白結蛋白(desmin)和膠質纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)的表達明顯增加，表明NAFLD病程向肝纖維化進一步惡化。 最為顯著的是脂肪代謝紊亂始終貫穿NAFLD的發(fā)生發(fā)展，特別是對NASH伴早期肝纖維化階段差異蛋白的IPA分析，我們發(fā)現(xiàn)兩條信號轉導通路被激活，分別是Akt/PKB通路和p3

7、8MAPK通路。首先，我們在NAFLD模型中，從蛋白水平和mRNA水平驗證了DIGE實驗結果的可靠性；其次，采用Westernblot技術檢測到NASH伴早期肝纖維化階段肝組織pho—Akt和pho—p38的表達明顯增加。內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)作為一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，通過模擬胰島素樣作用和加重炎癥反應得到人們的廣泛關注。因此，我們采用免疫組化技術和酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測到Visfatin不僅在NASH伴早期肝纖維化肝組織中表達

8、明顯增加，而且在其血清中也明顯增高，因此我們認為Visfatin通過激活Akt/PKB和p38MAPK通路，加重肝細胞內(nèi)TG的蓄積和肝組織炎癥反應，從而在NAFLD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。 與此同時，我們又采用SERPA技術篩選出18個與NAFLD發(fā)展密切相關的自身抗原，通過對自身抗原α—烯醇酶(α—enolase，ENOA)和蛋白二硫鍵異構酶3(Proteindisulfideisomeraseassociated3，PD