MicroRNA-34a在非酒精性脂肪性肝病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:
　　近年來隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD)的患病率逐年增加，成為常見的慢性肝病之一。而NAFLD發(fā)生發(fā)展機(jī)制目前尚未完全明確。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）與肝臟疾病關(guān)系密切，我們前期發(fā)現(xiàn)miR-34a在兩種NAFLD模型肝臟中表達(dá)均顯著上調(diào)，提示miR-34a可能在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用

2、。發(fā)掘并分析miR-34a的作用靶標(biāo)，對(duì)于揭示該miRNA的具體調(diào)節(jié)機(jī)制有著重要的作用。本研究以定量PCR(qPCR)的方法驗(yàn)證了miR-34a在NAFLD細(xì)胞和小鼠模型中的表達(dá)情況，并采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)研究miR-34a在NAFLD中的生物學(xué)功能。同時(shí)，對(duì)所預(yù)測(cè)的miR-34a作用靶點(diǎn)PPARα進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法:
　　1、采用游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)誘導(dǎo)L02細(xì)胞建立NAFLD

3、細(xì)胞模型，用高脂飲食(high fat diet，HFD)喂養(yǎng)C57BL/6小鼠構(gòu)建NAFLD動(dòng)物模型，采用qPCR法測(cè)定miR-34a在L02細(xì)胞及C57BL/6小鼠肝臟中的表達(dá)變化;
　　2、通過體外轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor或小鼠尾靜脈注射miR-34a基因敲減慢病毒載體的方式來進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。以油紅O染色、HE染色、生化分析探討miR-34a表達(dá)抑制對(duì)脂變及炎癥程度的影響;
　　3、結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miR

4、-34a靶基因的預(yù)測(cè)，并利用Western blot等進(jìn)行靶蛋白表達(dá)量的驗(yàn)證，同時(shí)利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)miR-34a的作用靶序列進(jìn)行鑒定。進(jìn)一步運(yùn)用Western blot、qPCR等方法觀察miR-34a表達(dá)變化后其靶標(biāo)基因PPARα下游脂變相關(guān)基因的表達(dá)變化;
　　4、進(jìn)一步運(yùn)用PPARαsiRNA探討PPARα表達(dá)抑制對(duì)離體肝細(xì)胞脂變程度的影響，運(yùn)用Western blot、 qPCR等方法觀察PPARα表達(dá)變化后其下游脂

5、變相關(guān)基因的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、在NAFLD細(xì)胞和小鼠肝組織中miR-34a的表達(dá)水平顯著上調(diào);
　　2、通過對(duì)L02細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor或小鼠尾靜脈注射miR-34a基因敲減慢病毒載體抑制miR-34a的表達(dá)，L02細(xì)胞胞漿及肝臟組織中脂滴沉積的程度得到顯著改善，甘油三酯的含量明顯下降，小鼠肝重/體重比值顯著下降，小鼠血清中AST水平顯著降低;
　　3、采用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)P

6、PARα是miR-34a可能的調(diào)控靶基因。我們?cè)贚02細(xì)胞及C57BL/6小鼠中檢測(cè)到PPARα在miR-34a表達(dá)抑制后其基因及蛋白水平均有上調(diào)。進(jìn)一步熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析證實(shí)PPARα是miR-34a的直接作用靶點(diǎn)，其3'-UTR中存在miR-34a調(diào)控的作用序列。PPARα的下游脂變相關(guān)基因的表達(dá)隨著PPARα的改變而改變。另外，通過抑制miR-34a的表達(dá)后，可以激活能量代謝通路上關(guān)鍵蛋白AMPK的表達(dá);
　　4、通過對(duì)細(xì)