Zebularine和Scriptaid對(duì)綿羊體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、體細(xì)胞核移植作為一項(xiàng)重要的生物技術(shù)，在構(gòu)建疾病模型、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、進(jìn)行治療性克隆等生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而自“多莉”誕生以來(lái)，雖有多種克隆動(dòng)物問(wèn)世，但克隆效率依然很低。目前認(rèn)為，體細(xì)胞核移植技術(shù)效率低下的主要原因是異常的表觀遺傳重編程，供體細(xì)胞核和重構(gòu)胚不完全的重編程成為抑制體細(xì)胞核移植技術(shù)發(fā)展的主要原因。
　　本研究采用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Zebularine和組蛋白去乙酰化酶抑制劑Scriptaid同時(shí)處理

2、綿羊供體卵丘細(xì)胞和體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚，以在降低DNA甲基化水平的同時(shí)提高組蛋白乙?；剑接懥似鋵?duì)體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚及胚胎發(fā)育相關(guān)基因OCT4、SOX2、H19、IGF2、Dnmt1 mRNA表達(dá)水平的影響。另外，對(duì)亮甲酚藍(lán)(BCB)染色選擇的卵母細(xì)胞是否有利于體細(xì)胞核移植胚胎的體外發(fā)育也進(jìn)行了研究。
　　為了選擇更優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞，在卵母細(xì)胞成熟前用BCB對(duì)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)進(jìn)行染色，根據(jù)細(xì)胞質(zhì)顏色將C

3、OCs分成兩組:BCB+組（染色后呈藍(lán)色）和BCB-組（染色后無(wú)色），未經(jīng)BCB處理的COCs為對(duì)照組，比較各組卵母細(xì)胞的成熟率及體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育率。結(jié)果表明，BCB+組卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于對(duì)照組和BCB-組(P＜0.05)，對(duì)照組卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于BCB-組(P＜0.05)。BCB+組和對(duì)照組體細(xì)胞核移植胚胎的卵裂率顯著高于BCB-組(P＜0.05)，BCB+組和對(duì)照組體細(xì)胞核移植胚胎的卵裂率差異不顯著（P＞0.05）。

4、BCB+組和對(duì)照組體細(xì)胞核移植胚胎的桑椹胚率顯著高于BCB-組(P＜0.05)，BCB+組和對(duì)照組體細(xì)胞核移植胚胎的桑椹胚率亦差異不顯著(P＞0.05)。BCB+組、對(duì)照組、BCB-組兩兩比較，體細(xì)胞核移植胚胎的囊胚率均具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　采用不同濃度(0、2.5、5、7.5、10 nmol/L) Zebularine處理綿羊體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚，結(jié)果表明，各濃度處理組之間體細(xì)胞核移植胚胎的卵裂率差異均不顯著（P＞

5、0.05），5nmol/L Zebularine處理組桑椹胚率顯著高于對(duì)照組和其他處理組(P＜0.05)，囊胚率亦以5nmol/L Zebularine處理組最高，達(dá)14.89％，顯著高于對(duì)照組及其他處理組(P＜0.05)。用5 nmol/L Zebularine處理體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚不同時(shí)間(0、12、24、48、96 h)后發(fā)現(xiàn)，24 h和48 h處理組的卵裂率顯著高于96h處理組(P＜0.05)，其他各組間的卵裂率差異不顯著(P＞

6、0.05)。96 h處理組的桑椹胚率顯著低于對(duì)照組和其他處理組(P＜0.05)，其他各組間差異不顯著(P＞0.05)。24 h處理組囊胚率最高，高達(dá)23.41％,顯著高于對(duì)照組和其他處理組(P＜0.05)。
　　以BCB+組卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞，用5 nmol/L Zebularine和0.2μmol/L Scriptaid同時(shí)處理綿羊供體卵丘細(xì)胞和重構(gòu)胚，T-BCB+組（Treat-BCB+組，即卵母細(xì)胞經(jīng)BCB染色且綿羊供體細(xì)

7、胞和重構(gòu)胚同時(shí)使用5 nmol/L Zebularine和0.2μmol/L Scriptaid處理）體細(xì)胞核移植胚胎卵裂率和桑椹胚率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但與C-BCB+組（Control-BCB+組，卵母細(xì)胞經(jīng)BCB染色且綿羊供體細(xì)胞和重構(gòu)胚都未經(jīng)過(guò)Zebularine和Scriptaid處理）差異不顯著(P＞0.05)。T-BCB+組、C-BCB+組、對(duì)照組（卵母細(xì)胞未經(jīng)BCB染色且綿羊供體細(xì)胞和重構(gòu)胚都未經(jīng)過(guò)Zebu

8、larine和Scriptaid處理）相鄰兩組間囊胚率差異顯著(P＜0.05)且T-BCB+組囊胚率最高，達(dá)28.25％。
　　用RT-qPCR的方法檢測(cè)IVF、Con-SCNT、Zeb+SCR-SCNT胚胎2-cell、4-cell、8-cell、桑椹胚和囊胚各時(shí)期OCT4、SOX2、H19、IGF2、Dnmt1基因mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，與IVF胚胎相比，體細(xì)胞核移植胚胎各發(fā)育階段基因表達(dá)變化趨勢(shì)相似，但相對(duì)表達(dá)量存在明顯

9、差異;Zeb+SCR-SCNT胚胎在各個(gè)發(fā)育階段OCT4、SOX2、H19、IGF2、Dnmt1基因mRNA表達(dá)水平與Con-SCNT胚胎相比，均更接近于IVF胚胎表達(dá)量。
　　綜上所述，BCB染色能夠挑選出更具發(fā)育潛能的卵母細(xì)胞。5 nmol/L Zebularine處理綿羊體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚24 h能夠顯著提高囊胚發(fā)育率。5 nmol/L Zebularine和0.2μmol/L Scriptaid同時(shí)處理綿羊供體卵丘細(xì)胞和重