茴香霉素結(jié)合電激活對(duì)豬孤雌激活和體細(xì)胞核移植胚胎的體外發(fā)育的影響.pdf

1、孤雌激活與體細(xì)胞核移植在動(dòng)物育種、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、建立動(dòng)物模型、保護(hù)珍稀瀕危動(dòng)物、提供人造器官異種移植研究以及發(fā)育生物學(xué)的研究等方面有著重要的作用與意義。而卵母細(xì)胞激活是影響孤雌激活和體細(xì)胞核移植效率的重要因素之一。同時(shí)也是確定孤雌激活和核移植以及隨后的克隆胚胎的發(fā)育的基本要素之一。因此，如何有效提高卵母細(xì)胞激活效率具有十分重要的意義。而茴香霉素是一種蛋白合成抑制劑，首次在牛孤雌激活胚胎和體細(xì)胞核移植激活處理上應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高牛的

2、孤雌激活胚胎和體細(xì)胞核移植胚胎囊胚率并提高囊胚質(zhì)量。但茴香霉素應(yīng)用在豬的孤雌激活胚胎和體細(xì)胞核移植胚胎尚未見(jiàn)報(bào)道。所以在本研究中，我們利用蛋白質(zhì)合成抑制劑茴香霉素在電激活后處理豬的孤雌激活胚胎和體細(xì)胞核移植胚胎來(lái)觀察實(shí)驗(yàn)效果。我們獲得以下試驗(yàn)結(jié)果:
　　1.茴香霉素， CB組與未處理組對(duì)比胚胎排出第二極體。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茴香霉素和未處理組與CB組相比在排出第二極體上差異顯著。(51.9％ and51.6％ vs.14.3％ p＜0.05

3、)，結(jié)果說(shuō)明茴香霉素不能抑制第二極體的排出。
　　2.茴香霉素在1μg/mL與其他各個(gè)濃度下的胚胎發(fā)育到2-4細(xì)胞階段有顯著差異(table3-2)。通過(guò)Hoechest33342染色的方法觀察茴香霉素處理組與對(duì)照組(CB)在囊胚的細(xì)胞數(shù)上沒(méi)有著顯著性差異(table2)，0.01μg/mL，0.1μg/mL藥物濃度與1μg/mL及對(duì)照組在達(dá)到囊胚的效率上有顯著地差異(31.8％ and27.1％ vs.0 and16.7％，p＜

4、0.05)。在最佳濃度下的茴香霉素處理不同的時(shí)間下觀察胚胎發(fā)育能力。分別測(cè)量了0h，2h，4h，6h，下胚胎的發(fā)育能力，結(jié)果顯示:茴香霉素是在處理2，4，6h下孤雌激活胚胎有最好的發(fā)育能力(39.5％，33.3％ and29.2％ vs.20.3％，p＜0.05)。同樣，在胚胎發(fā)育到2-4細(xì)胞時(shí)期，以及囊胚平均細(xì)胞數(shù)上都沒(méi)有顯著差異。以上結(jié)果表明:茴香霉素的最佳處理?xiàng)l件為0.01μg/mL下作用2h。
　　3.6-DMAP，茴香霉

5、素與未處理組對(duì)孤雌激活胚胎的影響，茴香霉素處理組和6-DMAP處理組與未處理組相比，在2-4細(xì)胞時(shí)期和囊胚平均細(xì)胞數(shù)上并無(wú)顯著性差異，在胚胎發(fā)育情況上，茴香霉素處理組和6-DMAP處理組與未處理組相比，能夠顯著提高孤雌激活胚胎發(fā)育能力(37.6％and30.0％ vs19.9％，p＜0.05)。
　　4.孤雌激活胚胎在0.01μg/mL茴香霉素作用4h下測(cè)量MPF活性，結(jié)果顯示茴香霉素處理下的孤雌生殖胚胎MPF水平明顯低于對(duì)照組(

6、361.3 pg/ml vs254.2pg/mL，p＜0.05)。
　　5.在染色體我們對(duì)激活7天左右的分別來(lái)自茴香霉素處理組，6-DMAP處理組和對(duì)照組(CB)處理的早期囊胚進(jìn)行核型分析。結(jié)果顯示茴香霉素與6-DMAP處理組和對(duì)照(CB)差異顯著(33.3％ vs60％ and50％，p＜0.05)以上結(jié)果表明:在茴香霉素處理下可以降低囊胚染色體異常比例。
　　6.PA胚胎在0.01μg/mL茴香霉素作用4h下通過(guò)RT-P

7、CR檢測(cè)多能性基因(Sox2，Oct4，Nanog)和凋亡基因(Blc-2，Bax)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明茴香霉素對(duì)PA囊胚的多能性基因和凋亡基因并無(wú)顯著性影響。
　　7.6-DMAP，茴香霉素與未處理組對(duì)SCNT胚胎的影響，茴香霉素處理組和6-DMAP處理組與未處理組相比，在2-4細(xì)胞時(shí)期和囊胚平均細(xì)胞數(shù)上并無(wú)顯著性差異，在胚胎發(fā)育情況上，茴香霉素處理組與未處理組相比，能夠顯著提高SCNT胚胎發(fā)育能力(18.3％ vs4.2％ p＜0.