AZD5438對豬孤雌激活與體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育的影響.pdf

1、現(xiàn)如今，豬卵母細(xì)胞激活方法和相關(guān)激活參數(shù)的研究已經(jīng)比較成熟，但激活的效率仍然很低。此外，由于卵母細(xì)胞激活是細(xì)胞核移植等生物技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，提高孤雌激活效率也可以促進(jìn)細(xì)胞核移植技術(shù)的提高。AZD5438是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制劑，在體外試驗(yàn)中，AZD5438可通過抑制CDK底物的磷酸化，從而阻斷細(xì)胞周期。本試驗(yàn)?zāi)康氖翘剿鰽ZD5438對豬孤雌激活與體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育的

2、影響，為研究新型的MPF抑制劑，優(yōu)化豬卵母細(xì)胞體外激活程序奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.試驗(yàn)探索了AZD5438的最佳處理?xiàng)l件。采用不同處理濃度（10μM，20μM和50μM）的AZD5438分別處理電激活后的豬卵母細(xì)胞孤雌激活(Parthenogenetic Activation，PA)胚胎，通過比較體外豬PA囊胚率得出，添加10μM AZD5438的試驗(yàn)組囊胚率最高，并且顯著高于5μg/ml細(xì)胞松弛

3、素B(cytochalasin B，CB)組(46.4％ vs.34.5％，P＜0.05)。隨后，采用10μM AZD5438分別處理電激活后的豬PA胚胎不同時(shí)間(2h，4h和6h)。結(jié)果表明，在10μM AZD5438處理4 h的條件下，豬PA囊胚發(fā)育率高于其他時(shí)間組(42.8％ vs.38.6％，37.2％)，但并無顯著差異性。
　　2.試驗(yàn)將AZD5438和6-二甲基氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine，6-

4、DMAP）對豬PA胚胎與體細(xì)胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT)胚胎早期發(fā)育的影響進(jìn)行比較。采用10μM AZD5438和2 mM6-DMAP分別處理電激活后的豬PA胚胎和豬SCNT胚胎4h，比較PA囊胚率和豬SCNT囊胚率。結(jié)果表明，10μM AZD5438處理4 h的條件下得到了與6-DMAP處理組相似的豬PA囊胚率(42.4％ vs.34.3％)和SCNT囊胚率(13.40％ vs.11

5、.11％)。
　　3.試驗(yàn)對經(jīng)10μM AZD5438處理4h后得到的豬PA囊胚進(jìn)行核型分析。結(jié)果表明，10μM AZD5438組豬囊胚中60％為二倍體，10％豬PA囊胚的為單倍體，10％豬PA囊胚的為四倍體，20％豬PA囊胚的為雜合體。
　　4.試驗(yàn)將使用10μM AZD5438和5μg/ml CB處理4h得到的豬PA胚胎內(nèi)成熟促進(jìn)因子(MPF)活性水平進(jìn)行測定。結(jié)果表明，10μM AZD5438處理顯著降低豬PA胚胎中M

6、PF活性水平(125.8 vs.288.7，P＜0.05)。
　　5.試驗(yàn)采用Real-time PCR方法檢測多能相關(guān)基因(Sox2、Oct4和Nanog)和凋亡相關(guān)基因(Bcl-2和Bax)的相對表達(dá)量，研究10μM AZD5438處理豬孤雌激活胚胎4 h后，對基因表達(dá)、胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果表明，10μM AZD5438處理豬PA胚胎4h，對多能相關(guān)基因(Sox2、Oct4和Nanog)和凋亡相關(guān)基因(Bcl-2和Bax)

7、的相對表達(dá)水平與CB對照組(5μg/ml)無顯著差異。
　　上述研究結(jié)果表明，AZD5438通過降低豬PA胚胎內(nèi)MPF活性水平來提高豬PA胚胎體外發(fā)育能力，并在10μM AZD5438處理4h的條件下，能夠提高豬孤雌激活胚胎與體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育水平。除此之外，孤雌囊胚中多能性相關(guān)基因(Sox2、Oct4和Nanog)和凋亡相關(guān)基因（Bax和Bcl-2）的相對mRNA表達(dá)水平?jīng)]有差異。證明AZD5438處理能夠提高孤雌胚的體外