TSA濃度及處理時(shí)間對(duì)豬體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育及轉(zhuǎn)基因eGFP表達(dá)的影響.pdf

1、通過體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術(shù)路線已經(jīng)成功獲得多種哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因克隆個(gè)體。然而，各物種的克隆效率仍不盡人意。近來有研究表明，表觀遺傳重編程（epigenetic reprogramming）在SCNT獲得的克隆胚胎的發(fā)育過程中扮演著重要角色；人們認(rèn)為重編程紊亂導(dǎo)致了大多數(shù)克隆胚胎的不正常發(fā)育。研究證明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase

2、inhibitor，HDACi）如曲古抑菌素A（tricho statin A，TSA）等的處理能顯著增強(qiáng)多個(gè)物種SCNT胚胎的發(fā)育能力。為改善豬克隆胚胎的發(fā)育能力，本實(shí)驗(yàn)嘗試優(yōu)化了TSA處理參數(shù)，并檢測(cè)了TSA對(duì)胚胎發(fā)育及轉(zhuǎn)基因eGFP表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)取得如下結(jié)果：
　　 對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞構(gòu)建的克隆胚胎分別采用0、20、40、60、80、100nM的TSA在激活后處理12h，結(jié)果顯示40nM處理組的囊胚率為35.65±9.5

3、8％，顯著高于其它各處理組及對(duì)照組的囊胚率（13.00±3.02％）（P<0.05）。40nM處理組發(fā)育至4-細(xì)胞期的胚胎數(shù)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），表明40nMTSA的處理可促進(jìn)4-細(xì)胞期發(fā)生的合子基因激活（zygotic gene activation，ZGA）事件。40nMTSA處理重構(gòu)胚12h和24h后，兩處理組重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率分別為16.32±1.51％和14.93±4.91％，二者差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明

4、40nMTSA處理12h或24h均可提高豬SCNT胚胎體外發(fā)育能力。
　　 以豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（PMSCs）、成纖維細(xì)胞（PFFs）和卵丘細(xì)胞（Cumulus）為核供體的重構(gòu)胚分別以40nM的TSA在激活后處理12h，結(jié)果顯示不同核供體來源的重構(gòu)胚在TSA處理后的囊胚發(fā)育率分別為17.39±14.64％、12.65±4.82％和2.90±5.02％，與對(duì)照組相比均有所提高，但組間差異不顯著（P>0.05）。將eGFP轉(zhuǎn)基因成纖

5、維細(xì)胞為核供體的豬重構(gòu)胚分別采用0、20、40、60、80、100、120和140nM的TSA在激活后處理12h，結(jié)果顯示TSA處理后組間的囊胚發(fā)育率差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明TSA可以提高不同供核細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)胚的體外發(fā)育能力。
　　 以人包皮成纖維細(xì)胞為核供體豬卵母細(xì)胞為核受體的人豬異種核移植（human-porcineinterspeciesnucleartransfer，hp-ISNT）囊胚發(fā)育率為1.07±1

6、.27％，顯著低于孤雌組的囊胚發(fā)育率（21.06±5.92％）（P<0.05）。hp-ISNT重構(gòu)胚4-細(xì)胞胚胎發(fā)育率為62.84±18.57％，顯著低于孤雌組（87.13±4.42％）（P<0.05）。結(jié)果表明hp-ISNT胚胎發(fā)育率較低可能與4-細(xì)胞期的ZGA事件不完全發(fā)生有關(guān)。40nMTSA處理hp-ISNT重構(gòu)胚24h，結(jié)果顯示TSA處理組與對(duì)照組間異種重構(gòu)胚的體外發(fā)育率無顯著差異（分別為0.74±1.47％和1.07±1.27

7、％）（P>0.05）。結(jié)果表明TSA不能顯著改善hp-ISNT胚胎的體外發(fā)育能力。
　　 5nMTSA對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行24h處理后，由其構(gòu)建的重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率為7.84±5.31％，顯著低于對(duì)照組（對(duì)胚胎及細(xì)胞均不進(jìn)行TSA處理）（P<0.05）。當(dāng)供體細(xì)胞以5nMTSA處理24h，重構(gòu)胚以40nMTSA處理24h后，重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率為48.96±10.17％，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)果表明TSA可以明顯改善eGFP

8、轉(zhuǎn)基因核移植胚胎的體外發(fā)育能力。
　　 對(duì)eGFP轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植胚胎的eGFP基因表達(dá)進(jìn)行熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，第一細(xì)胞周期內(nèi)的2h和12h明顯可以觀測(cè)到細(xì)胞核附近存在大量的eGFP蛋白。當(dāng)胚胎發(fā)育至2～4-細(xì)胞期時(shí)細(xì)胞核區(qū)的eGFP蛋白豐度較1-細(xì)胞胚胎的低。隨著胚胎發(fā)育至囊胚期，細(xì)胞核區(qū)的eGFP蛋白表達(dá)量較4-細(xì)胞胚胎有所增加。
　　 應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)手段，我們對(duì)比了TSA對(duì)克隆胚胎eGFP基因表達(dá)的影響。當(dāng)TSA