TSA濃度及處理時間對豬體細胞核移植胚胎體外發(fā)育及轉基因eGFP表達的影響.pdf

1、通過體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術路線已經成功獲得多種哺乳動物轉基因及非轉基因克隆個體。然而，各物種的克隆效率仍不盡人意。近來有研究表明，表觀遺傳重編程（epigenetic reprogramming）在SCNT獲得的克隆胚胎的發(fā)育過程中扮演著重要角色；人們認為重編程紊亂導致了大多數克隆胚胎的不正常發(fā)育。研究證明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase

2、inhibitor，HDACi）如曲古抑菌素A（tricho statin A，TSA）等的處理能顯著增強多個物種SCNT胚胎的發(fā)育能力。為改善豬克隆胚胎的發(fā)育能力，本實驗嘗試優(yōu)化了TSA處理參數，并檢測了TSA對胚胎發(fā)育及轉基因eGFP表達的影響。實驗取得如下結果：
　　 對豬胎兒成纖維細胞構建的克隆胚胎分別采用0、20、40、60、80、100nM的TSA在激活后處理12h，結果顯示40nM處理組的囊胚率為35.65±9.5

3、8％，顯著高于其它各處理組及對照組的囊胚率（13.00±3.02％）（P<0.05）。40nM處理組發(fā)育至4-細胞期的胚胎數顯著高于對照組（P<0.05），表明40nMTSA的處理可促進4-細胞期發(fā)生的合子基因激活（zygotic gene activation，ZGA）事件。40nMTSA處理重構胚12h和24h后，兩處理組重構胚的囊胚發(fā)育率分別為16.32±1.51％和14.93±4.91％，二者差異不顯著（P>0.05）。結果表明

4、40nMTSA處理12h或24h均可提高豬SCNT胚胎體外發(fā)育能力。
　　 以豬骨髓間充質干細胞（PMSCs）、成纖維細胞（PFFs）和卵丘細胞（Cumulus）為核供體的重構胚分別以40nM的TSA在激活后處理12h，結果顯示不同核供體來源的重構胚在TSA處理后的囊胚發(fā)育率分別為17.39±14.64％、12.65±4.82％和2.90±5.02％，與對照組相比均有所提高，但組間差異不顯著（P>0.05）。將eGFP轉基因成纖

5、維細胞為核供體的豬重構胚分別采用0、20、40、60、80、100、120和140nM的TSA在激活后處理12h，結果顯示TSA處理后組間的囊胚發(fā)育率差異不顯著（P>0.05）。結果表明TSA可以提高不同供核細胞構建的重構胚的體外發(fā)育能力。
　　 以人包皮成纖維細胞為核供體豬卵母細胞為核受體的人豬異種核移植（human-porcineinterspeciesnucleartransfer，hp-ISNT）囊胚發(fā)育率為1.07±1

6、.27％，顯著低于孤雌組的囊胚發(fā)育率（21.06±5.92％）（P<0.05）。hp-ISNT重構胚4-細胞胚胎發(fā)育率為62.84±18.57％，顯著低于孤雌組（87.13±4.42％）（P<0.05）。結果表明hp-ISNT胚胎發(fā)育率較低可能與4-細胞期的ZGA事件不完全發(fā)生有關。40nMTSA處理hp-ISNT重構胚24h，結果顯示TSA處理組與對照組間異種重構胚的體外發(fā)育率無顯著差異（分別為0.74±1.47％和1.07±1.27

7、％）（P>0.05）。結果表明TSA不能顯著改善hp-ISNT胚胎的體外發(fā)育能力。
　　 5nMTSA對供體細胞進行24h處理后，由其構建的重構胚的囊胚發(fā)育率為7.84±5.31％，顯著低于對照組（對胚胎及細胞均不進行TSA處理）（P<0.05）。當供體細胞以5nMTSA處理24h，重構胚以40nMTSA處理24h后，重構胚的囊胚發(fā)育率為48.96±10.17％，顯著高于對照組（P<0.05）。結果表明TSA可以明顯改善eGFP

8、轉基因核移植胚胎的體外發(fā)育能力。
　　 對eGFP轉基因體細胞核移植胚胎的eGFP基因表達進行熒光檢測發(fā)現(xiàn)，第一細胞周期內的2h和12h明顯可以觀測到細胞核附近存在大量的eGFP蛋白。當胚胎發(fā)育至2～4-細胞期時細胞核區(qū)的eGFP蛋白豐度較1-細胞胚胎的低。隨著胚胎發(fā)育至囊胚期，細胞核區(qū)的eGFP蛋白表達量較4-細胞胚胎有所增加。
　　 應用RT-PCR檢測手段，我們對比了TSA對克隆胚胎eGFP基因表達的影響。當TSA