漢坦病毒核蛋白基因疫苗在小鼠體內(nèi)表達(dá)動(dòng)力學(xué)的初步研究.pdf

1、目的腎綜合癥出血熱(Hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)是一種由漢坦病毒引起的急性病毒性傳染病，起病急、癥狀重、病死率高，且目前尚無有效的治療手段。因此，做好漢坦病毒的預(yù)防工作具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，核酸疫苗作為一種新生物技術(shù)的出現(xiàn)為我們防治HFRS提供了新的思路，其相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，代表者未來疫苗的發(fā)展方向。目前，已有研究者成功構(gòu)建了若干亞型的漢坦

2、病毒核酸疫苗，但研究重點(diǎn)更多的集中在核酸疫苗的免疫效果上，對(duì)于其在機(jī)體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)研究相對(duì)較少。因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含有漢坦病毒76-118株編碼核蛋白(Neucleoprotein，NP)S抗原基因片段的核酸疫苗，研究其在體外真核細(xì)胞中的表達(dá)，肌肉接種后在小鼠體內(nèi)組織分布及持續(xù)表達(dá)時(shí)間，進(jìn)而探討漢坦病毒核酸疫苗的應(yīng)用前景。 本實(shí)驗(yàn)以此為目的，進(jìn)行了以下研究：(1)以質(zhì)粒pEGFP-C1為載體，質(zhì)粒pTargeT/S中含有的S抗原基

3、因片段為目的基因，構(gòu)建GFP-NP融合蛋白真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP/S；(2)脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，觀察重組質(zhì)粒pEGFP/S在真核細(xì)胞中的表達(dá)；(3)免疫接種小鼠脛前肌，觀察pEGFP/S在小鼠體內(nèi)的組織分布及持續(xù)表達(dá)時(shí)間。 方法一、漢坦病毒S基因真核表達(dá)重組體的構(gòu)建使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Sa1Ⅰ消化質(zhì)粒pTargeT/S，純化得到S基因片斷，克隆至同樣經(jīng)EcoRⅠ、Sa1Ⅰ消化的質(zhì)粒pEGFP-C1上相應(yīng)

4、位點(diǎn)，酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pEGFP/S。使用超純質(zhì)粒中提試劑盒提取質(zhì)粒，-20℃保存。 二、脂質(zhì)體體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞人工復(fù)蘇培養(yǎng)Vero-E6細(xì)胞，使其在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中覆蓋率達(dá)到80％，胰酶消化后以每孔8×104-2.0×105個(gè)細(xì)胞的密度接種已鋪有蓋玻片(經(jīng)鹽酸酒精浸泡)的10個(gè)孔(12孔細(xì)胞培養(yǎng)板)中，12小時(shí)細(xì)胞爬片后以脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP/S(超純質(zhì)粒中提試劑盒提取)轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，48小時(shí)后按間接免

5、疫熒光法，固定封閉后分別滴加鼠抗NP單克隆抗體、羅丹明標(biāo)記山羊抗鼠二抗及DAPI染液，封片后熒光正置顯微鏡觀察。 三、免疫用質(zhì)粒pEGFP/S的擴(kuò)增、純化參照《分子克隆指南(第3版)》，首先將已轉(zhuǎn)入pEGFP/S的大腸桿菌DH5α，于30mlLB培養(yǎng)基培養(yǎng)中16～18小時(shí)，取25ml培養(yǎng)物于500mlLB培養(yǎng)基培養(yǎng)2.5h，加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，再繼續(xù)培養(yǎng)12～16h。堿裂解法大量提取培養(yǎng)物中質(zhì)粒后，

6、聚乙二醇法純化質(zhì)粒DNA，測(cè)量OD260/280，計(jì)算質(zhì)粒DNA濃度，儲(chǔ)存于-20℃。 四、小鼠的免疫接種6～8周齡雌性BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分為3組，實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組各14只，一組注射pEGFP/S質(zhì)粒，另一組注射PBS，另取2只作空白對(duì)照組。先在實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組小鼠雙側(cè)脛前肌分別注射0.75％利多卡因50μl預(yù)處理，次日于相同部位注射質(zhì)粒pEGFP/S100μg/只(實(shí)驗(yàn)組)，或PBS100μl/只(對(duì)照組)。 五、表

7、達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)接種后3d、7d、15d、30d、60d，隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各2只小鼠分別分離肝、脾、腎、肺、腦及局部肌肉組織，95％酒精中固定過夜后，由恒冷冰凍切片機(jī)制成7μm厚連續(xù)冰凍切片，鋪于多聚賴氨酸處理載玻片，封片后立即熒光顯微鏡觀察。 結(jié)果一、重組質(zhì)粒pEGFP/S的鑒定pEGFP/S陽性重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切消化后，可切出大小為1.3及4.7kb的2個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果相吻合。 二、熒光顯微鏡觀察

8、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡下觀察，在紫外激發(fā)下所有細(xì)胞的細(xì)胞核均發(fā)出藍(lán)色熒光，其中轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在藍(lán)光激發(fā)下可以觀察到載玻片上細(xì)胞發(fā)出綠色熒光；在綠光激發(fā)下可以觀察到紅色熒光；以PBS液代替一抗、二抗的對(duì)照組細(xì)胞只能在藍(lán)光激發(fā)下觀察到綠色熒光，其它對(duì)照組則未見熒光。 三、重組質(zhì)粒pEGFP/S在小鼠體內(nèi)組織分布及持續(xù)表達(dá)時(shí)間免疫后3d在實(shí)驗(yàn)組小鼠肝、肺、腎、脾、腦、肌肉各組織均檢測(cè)到較強(qiáng)的綠色熒

9、光，以后7d、15d、30d、60d各時(shí)間點(diǎn)處死的實(shí)驗(yàn)組小鼠在肝、腦、肺、腎、脾均檢測(cè)到綠色熒光，肌肉組織15d時(shí)仍可檢測(cè)到熒光，30d時(shí)熒光消失，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，所有組織中表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)量及熒光強(qiáng)度逐漸減弱，對(duì)照組未見任何熒光。 討論一、S基因、GFP基因?qū)h坦病毒核酸疫苗pEGFP/S的意義核蛋白(NP)是漢坦病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，有較強(qiáng)的免疫原性，可同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫，質(zhì)粒pEGFP-C1是一種可以在哺

10、乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)的真核表達(dá)載體，其含有的綠色熒光蛋白基因(GFP)在一定波長(zhǎng)的光線下可以激發(fā)出綠色熒光、且無需外源物質(zhì)參與，對(duì)細(xì)胞無毒性，攜帶GFP的融合蛋白既有綠色熒光又可保持靶蛋白的生理功能，在活細(xì)胞中可以直接觀察外源基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)利用GFP這個(gè)生理特性構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP/S，使我們可以更直觀的觀察漢坦病毒核酸疫苗在機(jī)體的分布及表達(dá)。 二、GFP-NP融合蛋白表達(dá)的意義我們?cè)跓晒怙@微鏡同一視野藍(lán)光和綠光激發(fā)下分

11、別觀察到了GFP及NP的表達(dá)，從而間接證明了GFP-NP融合蛋白可以在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)，為我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物免疫提供了科學(xué)依據(jù)。 三、肌肉免疫對(duì)pEGFP/S表達(dá)的意義肌肉注射核酸疫苗具有接種容量大、注射安全、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，本研究中使用0.75％利多卡因誘導(dǎo)后肌肉免疫pEGFP/S，在小鼠體內(nèi)取得了較好的免疫效果，證明了使用再生誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后肌肉注射對(duì)于pEGFP/S是一種較好的免疫方式。 四、pEGFP/S在機(jī)體內(nèi)

12、的分布表達(dá)的意義pEGFP/S免疫后可以在機(jī)體各組織內(nèi)持續(xù)表達(dá)較長(zhǎng)時(shí)間，這為機(jī)體免疫系統(tǒng)接受長(zhǎng)期的抗原刺激創(chuàng)造了條件，可以使機(jī)體長(zhǎng)期維持特異性的免疫力，從而證明了pEGFP/S是一種較理想的核酸疫苗。 五、pEGFP/S在腦組織中的表達(dá)質(zhì)粒DNA在腦組織中的表達(dá)缺乏功能強(qiáng)大的樹突狀細(xì)胞參與抗原遞呈，同時(shí)機(jī)體內(nèi)血-腦屏障的存在也會(huì)極大的影響質(zhì)粒DNA在腦組織的代謝。但在本研究中pEGFP/S在腦組織表達(dá)的持續(xù)時(shí)間與其它組織并無明顯

13、差異，提示機(jī)體內(nèi)的一些天然生理結(jié)構(gòu)對(duì)pEGFP/S在腦組織持續(xù)表達(dá)的影響并不顯著。 結(jié)論1.質(zhì)粒pEGFP-C1是我們研究漢坦病毒核酸疫苗一種較理想的載體。 2.pEGFP/S編碼的GFP-NP融合蛋白可以在體外真核細(xì)胞中獲得表達(dá)。 3.使用再生誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后肌肉注射對(duì)于pEGFP/S是一種較好的免疫方式。 4.肌肉免疫后pEGFP/S可以在機(jī)體內(nèi)廣泛分布，持續(xù)表達(dá)較長(zhǎng)時(shí)間。 5.機(jī)體內(nèi)的一些天然生