漢坦病毒核蛋白基因疫苗在小鼠體內表達動力學的初步研究.pdf

1、目的腎綜合癥出血熱(Hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)是一種由漢坦病毒引起的急性病毒性傳染病，起病急、癥狀重、病死率高，且目前尚無有效的治療手段。因此，做好漢坦病毒的預防工作具有重要的現(xiàn)實意義。近年來，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，核酸疫苗作為一種新生物技術的出現(xiàn)為我們防治HFRS提供了新的思路，其相對于傳統(tǒng)疫苗具有無可比擬的優(yōu)勢，代表者未來疫苗的發(fā)展方向。目前，已有研究者成功構建了若干亞型的漢坦

2、病毒核酸疫苗，但研究重點更多的集中在核酸疫苗的免疫效果上，對于其在機體內的動力學研究相對較少。因此，本實驗構建了含有漢坦病毒76-118株編碼核蛋白(Neucleoprotein，NP)S抗原基因片段的核酸疫苗，研究其在體外真核細胞中的表達，肌肉接種后在小鼠體內組織分布及持續(xù)表達時間，進而探討漢坦病毒核酸疫苗的應用前景。 本實驗以此為目的，進行了以下研究：(1)以質粒pEGFP-C1為載體，質粒pTargeT/S中含有的S抗原基

3、因片段為目的基因，構建GFP-NP融合蛋白真核表達重組質粒pEGFP/S；(2)脂質體體外轉染Vero-E6細胞，觀察重組質粒pEGFP/S在真核細胞中的表達；(3)免疫接種小鼠脛前肌，觀察pEGFP/S在小鼠體內的組織分布及持續(xù)表達時間。 方法一、漢坦病毒S基因真核表達重組體的構建使用限制性內切酶EcoRⅠ、Sa1Ⅰ消化質粒pTargeT/S，純化得到S基因片斷，克隆至同樣經(jīng)EcoRⅠ、Sa1Ⅰ消化的質粒pEGFP-C1上相應

4、位點，酶切鑒定，得到重組質粒pEGFP/S。使用超純質粒中提試劑盒提取質粒，-20℃保存。 二、脂質體體外瞬時轉染真核細胞人工復蘇培養(yǎng)Vero-E6細胞，使其在細胞培養(yǎng)瓶中覆蓋率達到80％，胰酶消化后以每孔8×104-2.0×105個細胞的密度接種已鋪有蓋玻片(經(jīng)鹽酸酒精浸泡)的10個孔(12孔細胞培養(yǎng)板)中，12小時細胞爬片后以脂質體介導重組質粒pEGFP/S(超純質粒中提試劑盒提取)轉染Vero-E6細胞，48小時后按間接免

5、疫熒光法，固定封閉后分別滴加鼠抗NP單克隆抗體、羅丹明標記山羊抗鼠二抗及DAPI染液，封片后熒光正置顯微鏡觀察。 三、免疫用質粒pEGFP/S的擴增、純化參照《分子克隆指南(第3版)》，首先將已轉入pEGFP/S的大腸桿菌DH5α，于30mlLB培養(yǎng)基培養(yǎng)中16～18小時，取25ml培養(yǎng)物于500mlLB培養(yǎng)基培養(yǎng)2.5h，加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，再繼續(xù)培養(yǎng)12～16h。堿裂解法大量提取培養(yǎng)物中質粒后，

6、聚乙二醇法純化質粒DNA，測量OD260/280，計算質粒DNA濃度，儲存于-20℃。 四、小鼠的免疫接種6～8周齡雌性BALB/c小鼠30只，隨機分為3組，實驗組對照組各14只，一組注射pEGFP/S質粒，另一組注射PBS，另取2只作空白對照組。先在實驗組對照組小鼠雙側脛前肌分別注射0.75％利多卡因50μl預處理，次日于相同部位注射質粒pEGFP/S100μg/只(實驗組)，或PBS100μl/只(對照組)。 五、表

7、達產(chǎn)物的檢測接種后3d、7d、15d、30d、60d，隨機將實驗組、對照組各2只小鼠分別分離肝、脾、腎、肺、腦及局部肌肉組織，95％酒精中固定過夜后，由恒冷冰凍切片機制成7μm厚連續(xù)冰凍切片，鋪于多聚賴氨酸處理載玻片，封片后立即熒光顯微鏡觀察。 結果一、重組質粒pEGFP/S的鑒定pEGFP/S陽性重組質粒經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切消化后，可切出大小為1.3及4.7kb的2個片段，與預期結果相吻合。 二、熒光顯微鏡觀察

8、瞬時轉染結果脂質體轉染Vero-E6細胞48h后，熒光顯微鏡下觀察，在紫外激發(fā)下所有細胞的細胞核均發(fā)出藍色熒光，其中轉染成功的細胞在藍光激發(fā)下可以觀察到載玻片上細胞發(fā)出綠色熒光；在綠光激發(fā)下可以觀察到紅色熒光；以PBS液代替一抗、二抗的對照組細胞只能在藍光激發(fā)下觀察到綠色熒光，其它對照組則未見熒光。 三、重組質粒pEGFP/S在小鼠體內組織分布及持續(xù)表達時間免疫后3d在實驗組小鼠肝、肺、腎、脾、腦、肌肉各組織均檢測到較強的綠色熒

9、光，以后7d、15d、30d、60d各時間點處死的實驗組小鼠在肝、腦、肺、腎、脾均檢測到綠色熒光，肌肉組織15d時仍可檢測到熒光，30d時熒光消失，且隨著時間的延長，所有組織中表達熒光的細胞數(shù)量及熒光強度逐漸減弱，對照組未見任何熒光。 討論一、S基因、GFP基因對漢坦病毒核酸疫苗pEGFP/S的意義核蛋白(NP)是漢坦病毒最主要的結構蛋白，有較強的免疫原性，可同時誘導機體產(chǎn)生體液免疫及細胞免疫，質粒pEGFP-C1是一種可以在哺

10、乳動物細胞中高效表達的真核表達載體，其含有的綠色熒光蛋白基因(GFP)在一定波長的光線下可以激發(fā)出綠色熒光、且無需外源物質參與，對細胞無毒性，攜帶GFP的融合蛋白既有綠色熒光又可保持靶蛋白的生理功能，在活細胞中可以直接觀察外源基因的表達。本實驗利用GFP這個生理特性構建了重組質粒pEGFP/S，使我們可以更直觀的觀察漢坦病毒核酸疫苗在機體的分布及表達。 二、GFP-NP融合蛋白表達的意義我們在熒光顯微鏡同一視野藍光和綠光激發(fā)下分

11、別觀察到了GFP及NP的表達，從而間接證明了GFP-NP融合蛋白可以在真核細胞中獲得表達，為我們在后續(xù)實驗的動物免疫提供了科學依據(jù)。 三、肌肉免疫對pEGFP/S表達的意義肌肉注射核酸疫苗具有接種容量大、注射安全、簡便易行等優(yōu)點，本研究中使用0.75％利多卡因誘導后肌肉免疫pEGFP/S，在小鼠體內取得了較好的免疫效果，證明了使用再生誘導劑誘導后肌肉注射對于pEGFP/S是一種較好的免疫方式。 四、pEGFP/S在機體內

12、的分布表達的意義pEGFP/S免疫后可以在機體各組織內持續(xù)表達較長時間，這為機體免疫系統(tǒng)接受長期的抗原刺激創(chuàng)造了條件，可以使機體長期維持特異性的免疫力，從而證明了pEGFP/S是一種較理想的核酸疫苗。 五、pEGFP/S在腦組織中的表達質粒DNA在腦組織中的表達缺乏功能強大的樹突狀細胞參與抗原遞呈，同時機體內血-腦屏障的存在也會極大的影響質粒DNA在腦組織的代謝。但在本研究中pEGFP/S在腦組織表達的持續(xù)時間與其它組織并無明顯

13、差異，提示機體內的一些天然生理結構對pEGFP/S在腦組織持續(xù)表達的影響并不顯著。 結論1.質粒pEGFP-C1是我們研究漢坦病毒核酸疫苗一種較理想的載體。 2.pEGFP/S編碼的GFP-NP融合蛋白可以在體外真核細胞中獲得表達。 3.使用再生誘導劑誘導后肌肉注射對于pEGFP/S是一種較好的免疫方式。 4.肌肉免疫后pEGFP/S可以在機體內廣泛分布，持續(xù)表達較長時間。 5.機體內的一些天然生