鹽酸關(guān)附甲素對(duì)心肌鈉通道及輔助亞基調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、第一部分乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)
　　目的:為第二部分及第三部分藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)提供合格心肌細(xì)胞。方法:以出生24小時(shí)以內(nèi)乳鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，酶分離法于無菌條件下消化分離出單個(gè)心肌細(xì)胞，使用差速貼壁法分離純化心肌細(xì)胞。用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于CO2濃度為5％的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)心肌細(xì)胞。每24小時(shí)換二分之一體積培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞搏動(dòng)頻率大于100次/分后，可進(jìn)行第二部分實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:成功培養(yǎng)出可自主搏動(dòng)的心肌細(xì)胞25次，

2、且細(xì)胞搏動(dòng)頻率均達(dá)100次/分以上。結(jié)論:乳鼠出生時(shí)間越短，其心肌細(xì)胞活性越強(qiáng)。嚴(yán)格無菌操作是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ);分離消化過程中減少組織細(xì)胞損傷是細(xì)胞存活的前提;培養(yǎng)過程中保持細(xì)胞所處環(huán)境穩(wěn)定，是提高原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞質(zhì)量的保障。
　　第二部分:鹽酸關(guān)附甲素及胺碘酮對(duì)乳鼠離體心肌細(xì)胞干預(yù)
　　目的:探討鹽酸關(guān)附甲素(Guanfu base A，GFA)及胺碘酮(Amiodar, Amio)孵育離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞后，其自主搏動(dòng)節(jié)律的

3、變化情況。方法:以第一部分實(shí)驗(yàn)所得的心肌細(xì)胞，為本部分實(shí)驗(yàn)材料。使用不同濃度的GFA及Amio孵育細(xì)胞，分別在孵育3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小后觀察，計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率。觀察不同干預(yù)條件，心肌自主搏動(dòng)頻率變化。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察完畢后，收集細(xì)胞，于-80℃保存，作為第三部分實(shí)驗(yàn)材料。結(jié)果:GFA及Amio對(duì)心肌細(xì)胞自主搏動(dòng)均有抑制作用。GFA抑制作用與孵育時(shí)間及藥物濃度呈正相關(guān)，Amio抑制作用與孵育時(shí)間相關(guān)性更強(qiáng)。當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到一定

4、長度后，兩種藥物對(duì)心肌細(xì)胞自主搏動(dòng)頻率的抑制差異不再具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:GFA及Amio均可抑制離體心肌細(xì)胞自主搏動(dòng)，且兩者抑制效果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　第三部分:鹽酸關(guān)附甲素及胺碘酮對(duì)心肌細(xì)胞鈉通道及其輔助亞基表達(dá)的影響
　　目的:檢測兩種藥物對(duì)心肌細(xì)胞鈉通道及其輔助亞基表達(dá)的影響。方法:提取每組標(biāo)本總mRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄(RT)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，選擇GAPDH為內(nèi)參，檢測鈉通道SCN5A，SCN1B，SCN