益氣除濕方對(duì)MG患者及EAMG大鼠血清AChR抗體和可溶性PD-L1分子的影響.pdf

1、重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)主要病變部位涉及到人體神經(jīng)和肌肉接頭上的乙酰膽堿的受體(acetylcholine receptor,AChR)，這種受體位于接頭的突觸后膜上，而起主要介導(dǎo)作用的是乙酰膽主要堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody,AChRab)，這種病變過程依賴的是細(xì)胞免疫(cell-mediated immunity,CMI)，當(dāng)然補(bǔ)體也參與這個(gè)病的這個(gè)病的產(chǎn)生

2、發(fā)展過程，重癥肌無力是一種常見的并且非常典型的自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)。該病在臨床上表現(xiàn)為活動(dòng)后癥狀嚴(yán)重的全身或者部分的骨胳肌的勞累甚至無力的現(xiàn)象，但是通過休息后肌無力的癥狀會(huì)緩解，甚至部分病人可以達(dá)到完全正常的暫時(shí)狀態(tài)，同時(shí)該病具有傍晚較晨起后癥狀較更為嚴(yán)重的特征，即晨輕暮重的特點(diǎn)。重癥肌無力目前是一種世界性的不容易治療的疾病，西醫(yī)方面的治療的藥物主要是激素和乙酰膽堿抑制劑，這兩種藥物在治療重癥肌

3、無力的同時(shí)會(huì)出現(xiàn)一些的不良反應(yīng)，中醫(yī)藥在治療重癥肌無力的過程中發(fā)現(xiàn)了一些療效確切，同時(shí)又可以緩解西藥不良反應(yīng)的中藥和治療方法。益氣除濕方是導(dǎo)師譚子虎教授從?治痿獨(dú)取陽(yáng)明?的理論出發(fā),結(jié)合眾多醫(yī)家治痿學(xué)說以及在臨床上積累的多年的經(jīng)驗(yàn)，擬定的治療重癥肌無力的中藥制劑，無論是在臨床觀察方面還在在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，都取得了療效確切的結(jié)論。
　　第一部分益氣除濕方對(duì)MG患者臨床療效及血清AChR抗體和可溶性PD-L1分子的影響
　　目的

4、：觀察益氣除濕方治療重癥肌無力的臨床療效，包括臨床療效顯效率，絕對(duì)評(píng)分和相對(duì)評(píng)分，中醫(yī)證候療效，中醫(yī)證候積分；觀察益氣除濕方對(duì)重癥肌無力患者血清AChR抗體滴度的影響；觀察益氣除濕方對(duì)重癥肌無力患者血清可溶性PD-L1分子含量的影響，從免疫學(xué)指標(biāo)判定益氣除濕方對(duì)重癥肌無力癥狀改善的機(jī)制研究。
　　方法：觀察52例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的重癥肌無力患者，按照事先準(zhǔn)備好的隨機(jī)序列表，將受試者按1：1比例隨機(jī)分配到兩個(gè)組中：治療組26例；對(duì)照組2

5、6例，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。對(duì)照組服用強(qiáng)的松聯(lián)合溴吡斯的明片，治療組在對(duì)照組治療方法上給予益氣除濕方煎劑口服。治療組、對(duì)照組全部用藥及觀察均為8周。所有受試患者分別于治療前、治療結(jié)束后進(jìn)行問診、查體及相關(guān)生化檢查，填寫臨床觀察表，進(jìn)行療效評(píng)價(jià)及安全性觀察。觀察治療前后的臨床療效，絕對(duì)評(píng)分和相對(duì)評(píng)分，中醫(yī)證候療效，中醫(yī)證候積分，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；使用人乙酰膽堿受體抗體（AChRab）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定治療前后患者血清AChR抗體滴度，并進(jìn)

6、行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；使用人細(xì)胞程序性死亡蛋白1配體1(PDCD1LG1)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒血清可溶性PD-L1分子含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：益氣除濕方對(duì)重癥肌無力具有明顯的療效，從總的臨床療效積分變化統(tǒng)計(jì)：治療組顯效率96.15％，對(duì)照組顯效率88.46%，二者相比較，治療組療效優(yōu)于對(duì)照組，具有顯著性差異(P＜0.05)；從絕對(duì)評(píng)分來看，治療后治療組與對(duì)照組的絕對(duì)評(píng)分分別為5.54±4.12、7.71±1.78，二者相比較

7、，治療組療效優(yōu)于對(duì)照組，具有顯著性差異(P＜0.05)；治療組與對(duì)照組相對(duì)評(píng)分分別為53.59±25.33、37.89±19.93，二者相比較，治療組療效優(yōu)于對(duì)照組；從中醫(yī)證候積分變化統(tǒng)計(jì)：治療組有效率88.46%，對(duì)照組有效率為57.69%，兩組中醫(yī)證候改善情況有顯著差異(P＜0.05),提示治療組在中醫(yī)證候改善方面明顯優(yōu)于對(duì)照組。研究還發(fā)現(xiàn)，益氣除濕方治療組有2例患者出現(xiàn)了輕度惡心嘔吐的胃腸道的輕度的不適表現(xiàn)，未影響到實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，未

8、發(fā)現(xiàn)益氣除濕方治療組有在心電圖、肝功能、腎功能、空腹血糖受損、股骨頭壞死等方面的病理現(xiàn)象的產(chǎn)生；西藥對(duì)照組治療后出現(xiàn)輕度肝功能下降的有2個(gè)人，表現(xiàn)在總膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶的升高，除此之外空腹血糖增高高于6.1mmol/L的有1人，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組之間存在于差異性，說明益氣除濕方治療組較西藥對(duì)照組相比，表現(xiàn)出的安全性方面的指數(shù)更具有可靠性。治療后治療組與對(duì)照組血清AChR抗體水平與治療前相比顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后治療

9、組與對(duì)照組血清可溶性PD-L1分子水平與治療前相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：益氣除濕方聯(lián)合基礎(chǔ)西藥能明顯改善重癥肌無力患者的臨床癥狀，中醫(yī)證候，絕對(duì)評(píng)分和相對(duì)評(píng)分，且優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用基礎(chǔ)西藥治療，同時(shí)未見無明顯毒副作用。益氣除濕方能降低血清AChR抗體滴度，并優(yōu)于對(duì)照組。益氣除濕方與西藥均能升高血清可溶性PD-L1含量，但二者無明顯差異性。益氣除濕方聯(lián)合基礎(chǔ)西藥通過增加可溶性PD-L1的血清含量，直接影響受體

10、/配體相互作用的PD-1/PD-L1負(fù)性共刺激信號(hào)，PD-1/PD-L1聯(lián)合作用共同阻滯CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖以及IL-2的分泌，在細(xì)胞周期的G0/G1期細(xì)胞周期時(shí)間延長(zhǎng)，并減少IFN-γ，IL-2和IL-10的含量，這些細(xì)胞因子的分泌減少，使得乙酰膽堿受體抗體合成減少；同時(shí)可溶性PD-L1分子可以參與血液循環(huán)，同細(xì)胞因子一樣，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，增加可溶性PD-L1分子的含量，作為一種阻斷性分子，在與表面PD-1結(jié)合單

11、個(gè)核細(xì)胞的發(fā)生率增加，即可減少膜型PD-L1和PD-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上合成的可能性，同時(shí)組織和細(xì)胞，單核細(xì)胞表面的相互作用顯著性增強(qiáng)，同時(shí)活化T細(xì)胞獲得足夠強(qiáng)度的負(fù)控制信號(hào)，避免過量T細(xì)胞的活化增殖性，對(duì)自身抗原的免疫反應(yīng)引起的持續(xù)，減少組織損傷。減少乙酰膽堿受體抗體的合成可以減少乙酰膽堿受體的抗體，抑制功能的緩慢溶解，補(bǔ)體介導(dǎo)的同時(shí)，突觸后膜和突觸后膜受體數(shù)量增加，從而減少重癥肌無力的癥狀。
　　第二部分益氣除濕方對(duì)EA

12、MG大鼠血清AChR抗體和可溶性PD-L1分子的影響
　　目的：制備實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）大鼠模型，通過服用益氣除濕方后，觀察大鼠的臨床癥狀、血清可溶性PD-L1及AChR抗體的含量變化，探討重癥肌無力的發(fā)病機(jī)制及益氣除濕方治療重癥肌無力的作用機(jī)制，為進(jìn)一步在臨床上更好的運(yùn)用益氣除濕方提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：將健康成年的雌性的Lewis大鼠40只，隨機(jī)地抽取10只作為空白對(duì)照組(A組)，剩余大鼠皮下注射鼠源

13、AChR-α亞基97-116肽段進(jìn)行 EAMG造模，把造模后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為模型西藥對(duì)照組(B組)、西藥對(duì)照組(C組)、益氣除濕方組(D組)，每組為10只，目前4組。造模成功2周后，A組與B組給予生理鹽水灌胃，C組給予強(qiáng)的松灌胃，D組給予益氣除濕方灌胃，4周后進(jìn)行Lennon癥狀分級(jí)的分值測(cè)定、血清AChR抗體滴度的測(cè)定和血清可溶性PD-L1含量的檢測(cè)。
　　結(jié)果：Lennon臨床評(píng)分達(dá)0.5-1級(jí)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)肌無力癥狀愈

14、加顯著，至造模結(jié)束時(shí)臨床評(píng)分在1級(jí)以上者占造模數(shù)量的75.39%；使用五赫茲連續(xù)10次的低頻電刺激檢測(cè)28只已造模完畢的實(shí)驗(yàn)大鼠，共有25只大鼠第五個(gè)肌電波的波幅比第一個(gè)肌電波的波幅降低百分之十以上，即衰減率大于或等于百分之十，平均為(19.35士3.89)，其余3只大鼠的電衰減率小于百分之十，而空白對(duì)照組第五個(gè)肌電波的波幅比第一個(gè)肌電波的波幅降低均不超過百分之十；新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性者為26只。EAMG大鼠血清AChR抗體含量較健康大鼠含

15、量高，可溶性PD-L1分子含量較健康大鼠含量低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明血清AChR抗體、可溶性 PD-L1分子在重癥肌無力的發(fā)病中具有重要意義。益氣除濕方、強(qiáng)的松均能改善EAMG大鼠肌無力癥狀，影響大鼠的體重，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，益氣除濕方明顯優(yōu)于強(qiáng)的松（P＜0.05）。益氣除濕方組、強(qiáng)的松組血清AChR抗體含量均較模型組明顯降低(P＜0.05)。益氣除濕方、強(qiáng)的松均能降低EAMG大鼠血清AChR抗體濃度，益氣除濕

16、方減低血清AChR抗體濃度的程度不及強(qiáng)的松（P＞0.05）。益氣除濕方、強(qiáng)的松均能增加EAMG大鼠血清可溶性PD-L1分子含量，益氣除濕方增加血清可溶性PD-L1分子含量的程度優(yōu)于強(qiáng)的松（P＜0.05）。
　　結(jié)論：用皮下注射鼠源性 AChR-α亞基97-116肽段可以有效制作EAMG模型，并且具有成功率高的特點(diǎn)。益氣除濕方能提高EAMG大鼠的體重、肌力和運(yùn)動(dòng)能力，抑制EAMG模型大鼠血清中AChR抗體濃度，增加血清可溶性 PD-

17、L1分子含量。益氣除濕方聯(lián)合基礎(chǔ)西藥通過增加可溶性PD-L1的血清含量，直接影響受體/配體相互作用的PD-1/PD-L1負(fù)性共刺激信號(hào)，PD-1/PD-L1聯(lián)合作用共同阻滯CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖以及IL-2的分泌，在細(xì)胞周期的G0/G1期細(xì)胞周期時(shí)間延長(zhǎng)，并減少IFN-γ，IL-2和IL-10的含量，這些細(xì)胞因子的分泌減少，使得乙酰膽堿受體抗體合成減少；同時(shí)可溶性PD-L1分子可以參與血液循環(huán)，同細(xì)胞因子一樣，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中

18、發(fā)揮作用，增加可溶性PD-L1分子的含量，作為一種阻斷性分子，在與表面 PD-1結(jié)合單個(gè)核細(xì)胞的發(fā)生率增加，即可減少膜型PD-L1和PD-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上合成的可能性，同時(shí)組織和細(xì)胞，單核細(xì)胞表面的相互作用顯著性增強(qiáng)，同時(shí)活化T細(xì)胞獲得足夠強(qiáng)度的負(fù)控制信號(hào)，避免過量T細(xì)胞的活化增殖性，對(duì)自身抗原的免疫反應(yīng)引起的持續(xù)，減少組織損傷。減少乙酰膽堿受體抗體的合成可以減少乙酰膽堿受體的抗體，抑制功能的緩慢溶解，補(bǔ)體介導(dǎo)的同時(shí)，突觸后膜