抗CD1d分子抗體制備及可溶性CD1d分子ELISA方法建立.pdf

1、目的: (1)克隆人CD1d編碼基因； (2)制備人CD1d胞外區(qū)重組蛋白及其特異性抗體； (3)制備人CD1d a3結(jié)構(gòu)域重組蛋白及其特異性抗體； (4)建立檢測(cè)可溶性人CD1d分子的ELISA方法。 方法: (1)通過RT-PCR克隆人CD1d編碼區(qū)基因，PCR產(chǎn)物連接T載體，DNA測(cè)序鑒定。 (2)設(shè)計(jì)特異引物，分別擴(kuò)增人CD1d胞外區(qū)和人CD1d a3結(jié)構(gòu)域的編碼基因，通過

2、酶切、連接，將目的片段插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET28，分別構(gòu)建pET28/CD1d及pET28/CD1d-a3表達(dá)載體。 (3)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，以IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，并利用Ni-NTA層析柱純化重組蛋白。 (4)分別將純化的人CD1d胞外區(qū)重組蛋白和人CD1d a3結(jié)構(gòu)域重組蛋白免疫家兔和小鼠，分別制備兔抗人CD1d胞外區(qū)抗體和鼠抗人CD1da3結(jié)構(gòu)域抗體。 (5)以間接ELISA測(cè)定抗

3、體效價(jià)，利用免疫組化和Western blot鑒定抗體的特異性。 (6)利用SPA法純化抗體，利用制備的上述抗體，建立雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)可溶性人CD1d分子。 (7)利上述建立的ELISA方法，檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等患者血清標(biāo)本中的CD1d分子的表達(dá)水平，并對(duì)其臨床意義進(jìn)行了初步分析。 結(jié)論: (1)成功克隆了人CDld編碼區(qū)基因；(2)通過自行制備重組蛋白，成功制備了效價(jià)較高的鼠抗人