可溶性PD-1分子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是累及關(guān)節(jié)滑膜的慢性自身免疫性疾病，在我國(guó)的患病率約為0.4％，以慢性、對(duì)稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。目前的研究顯示RA與T細(xì)胞功能異常介導(dǎo)的自身免疫損傷密切相關(guān)，過度活化的T淋巴細(xì)胞也是RA免疫病理進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)。
　　 T細(xì)胞活化需要雙信號(hào):第一信號(hào)由T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別抗原提呈細(xì)胞(APC)表面的抗原肽-MHC復(fù)合物(p-MHC)啟動(dòng);

2、第二信號(hào)由T細(xì)胞和APC間協(xié)同刺激分子的相互作用啟動(dòng)，B7/CD28是其中最重要的一對(duì)協(xié)同刺激分子。近幾年，B7/CD28家族成員不斷擴(kuò)大，PD-1（Programmed death-1）是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激分子，由PDCD1基因編碼。一系列研究表明，PD-1通過與其兩個(gè)配體PD-L1和PD-L2作用而抑制T、B細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在維持機(jī)體免疫耐受上發(fā)揮至關(guān)重要的作用。同時(shí)，PD-1分子也與一系列疾病的免疫病理發(fā)生發(fā)展密切

3、相關(guān)。因此，PD-1分子成為近年來免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，有望成為腫瘤、自身免疫性疾病和病毒感染性疾病的免疫干預(yù)治療的有效靶分子。
　　 本課題擬通過檢測(cè) RA患者與骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)患者，健康對(duì)照(Healthy Controls，HC)外周血可溶性PD-1（soluble PD-1，sPD-1）的表達(dá)，結(jié)合RA患者臨床分期、臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，探討sPD-1在RA患者中的表達(dá)及其功能，通過分析RA患

4、者外周血IFN-γ、IL-4、IL-17A等細(xì)胞因子的表達(dá)和不同SNP基因型患者sPD-1表達(dá)的差異，探討sPD-1在RA患者中異常表達(dá)的分子機(jī)制。
　　 第一部分可溶性PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)及其功能的初步研究。
　　 目的:研究可溶性PD-1分子(soluble PD-1，sPD-1)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)和臨床意義，初步研究sPD-1對(duì)PD-1/PD-L1信號(hào)通路的影響。
　　 方法:通過

5、本實(shí)驗(yàn)室前期研制的sPD-1分子ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)sPD-1在RA患者外周血中的表達(dá)，分析sPD-1與RA患者臨床分期、臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)RA患者外周血CD4+T細(xì)胞上膜型PD-1(mPD-1)的表達(dá);使用Real Time PCR檢測(cè)flPD-1、PD-1Δex3，從mRNA水平驗(yàn)證mPD-1和sPD-1在RA患者中的表達(dá);通過CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法研究sPD-1對(duì)CD4+T細(xì)胞體外增殖的

6、影響。結(jié)果:①RA患者外周血sPD-1的含量為38.39±5.45ng/ml，顯著高于HC(20.56±1.29ng/ml，P=0.0003)和OA(21.88±2.35ng/ml，P=0.0493)，急性活動(dòng)期患者sPD-1的表達(dá)顯著高于慢性緩解期(P=0.0027);②RF陽性RA患者sPD-1的表達(dá)明顯高于RF陰性患者(P=0.0491)，sPD-1與RF滴度、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)呈正相關(guān)(r=0.2668，P=0.0411; r=0.43

7、65，P=0.0003);③急性活動(dòng)期RA患者外周血CD4+T細(xì)胞mPD-1的表達(dá)明顯高于HC(P＜0.001)和OA(P＜0.001);④mRNA水平RA患者PD-1Δex3的表達(dá)明顯高于HC(P=0.0346)和OA(P=0.0401)，與ELISA結(jié)果一致，flPD-1的表達(dá)高于HC(P=0.0057)和OA(P=0.0457)，與FCM的結(jié)果一致;⑤PD-L1對(duì)CD4+T細(xì)胞的體外增殖具有顯著的抑制作用，而這種抑制作用可被sPD

8、-1逆轉(zhuǎn)(P=0.0035)。
　　 結(jié)論:RA患者外周血sPD-1明顯上調(diào)，并與臨床分期、臨床癥狀和預(yù)后相關(guān)，sPD-1可干預(yù)PD-1/PD-L1信號(hào)通路，在RA的免疫病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分可溶性PD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中異常表達(dá)的分子機(jī)制的初步研究。
　　 第一節(jié)RA患者外周血細(xì)胞因子的表達(dá)及與PD-1Δex3的相關(guān)性。
　　 目的:研究T細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子IFN-Υ、IL-

9、4、IL-10、IL-17A、IL-21在RA患者中的表達(dá)，PD-1Δex3與RA患者失衡的細(xì)胞因子的相關(guān)性。
　　 方法:ELISA檢測(cè)T細(xì)胞體外活化各時(shí)相IFN-γ、IL-4、IL-10的變化，RealTimePCR檢測(cè)靜息狀態(tài)下mRNA水平IFN-γ、 IL-4、IL-10、IL-17A、IL-21在RA患者PBMC中的表達(dá)，并結(jié)合RA患者PD-1Δex3的表達(dá)做相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:①IFN-γ、 IL-4、

10、IL-10在T細(xì)胞體外活化各時(shí)相的表達(dá)呈上升趨勢(shì);②RA患者IFN-γmRNA水平的表達(dá)明顯高于HC(P=0.0421)，與OA無明顯差異(P=0.1637)，IFN-γ與PD-1Δex3的表達(dá)具有明顯的正相關(guān)性(r=0.4633，P=0.0026);③RA患者IL-4mRNA水平的表達(dá)明顯高于HC(P=0.0359)和OA(P=0.0499)，與PD-1Δex3的表達(dá)具有明顯的正相關(guān)性(r=0.4109，P=0.0069);④RA患者

11、IL-10mRNA水平的表達(dá)與HC(P=0.4104)和OA(P=0.2267)無明顯差異，IL-10與PD-1Δex3的表達(dá)具有正相關(guān)性(r=0.4374，P=0.0048);⑤RA患者IL-17A mRNA水平的表達(dá)明顯高于HC(P=0.0420)和OA(P=0.0428)，IL-17A與PD-1Δex3的表達(dá)具有明顯的正相關(guān)性(r=0.4065，P=0.0092);⑥RA患者IL-21的表達(dá)明顯高于HC組(P=0.0425)，但與

12、OA組無明顯差異(P=0.0702)，與PD-1Δex3的表達(dá)無明顯相關(guān)性（r=0.1761，P=0.2471）。
　　 結(jié)論:T細(xì)胞亞群的異常活化，相關(guān)炎性細(xì)胞因子的上調(diào)可能與sPD-1的產(chǎn)生有關(guān)，為進(jìn)一步研究T細(xì)胞亞群在RA免疫病理進(jìn)程中的作用，以及對(duì)sPD-1的調(diào)控提供新的思路。
　　 第二節(jié)PDCDI基因多態(tài)性與sPD-1的表達(dá)。
　　 目的:尋找RA患者內(nèi)含子2-外顯子3-內(nèi)含子3序列的SNP位點(diǎn)，研究

13、選擇性剪接異構(gòu)體PD-1Δex3的產(chǎn)生與RA患者遺傳背景的關(guān)系。
　　 方法:通過PCR-直接測(cè)序的方法掃描PDCDI基因內(nèi)含子2-外顯子3-內(nèi)含子2序列，篩查該序列內(nèi)中國(guó)人群特異性SNP位點(diǎn);對(duì)中國(guó)人群RA患者和健康對(duì)照候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，分析SNP位點(diǎn)與RA的相關(guān)性;將SNP的基因分型結(jié)果與RA患者sPD-1的表達(dá)進(jìn)行綜合分析。
　　 結(jié)果:①發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列上存在3個(gè)SNP位點(diǎn)，其中SNP2和SNP3為新發(fā)現(xiàn)位

14、點(diǎn)，生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)這3個(gè)SNP位點(diǎn)分別位于剪接因子SRp40、SC35和SF2/ASF的結(jié)合靶點(diǎn)內(nèi);②SNP1(rs34819629)G等位基因在RA病人組中的分布頻率明顯大于正常對(duì)照組(P=0.021)，基因型頻率分布在RA病例和對(duì)照組之間的分布有顯著性差異(P=0.037)，最佳遺傳模式為加性;③SNP1 G/G和A/G基因型RA患者sPD-1的表達(dá)明顯高于A/A基因型RA患者(P=0.0237，P=0.0488)。