姜黃素對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠卵巢癌細(xì)胞系增殖和遷移能力的影響及相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制的研究.pdf

1、姜黃素（Curcumin，Cur）是從姜科姜黃屬植物的根莖中提取的一種酚類色素，其主要藥理作用包括抗炎、抗氧化、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗病毒等，且毒性較低。Cur的抗腫瘤作用目前已得到共識(shí)，但是關(guān)于Cur干預(yù)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體機(jī)制國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少。
　　 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系作為一個(gè)較為理想的體系，不僅可以用于檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)維系所必需的獨(dú)立通路，同時(shí)可以探究腫瘤對(duì)于通路靶向治療的敏感性的分子機(jī)制。本研究通過應(yīng)用T3（p

2、53-/-，K-ras，Akt）腫瘤細(xì)胞系，觀察Cur對(duì)T3細(xì)胞系增殖的抑制情況及腫瘤遷移能力的影響，同時(shí)對(duì)所轉(zhuǎn)染的癌基因 Akt及其活化形式磷酸化Akt（p-Akt）和K-ras蛋白表達(dá)，以及對(duì)PI3K/Akt通路中重要環(huán)節(jié)PI3K蛋白的檢測(cè)，從而探討Cur可能存在的抗癌作用的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、T3細(xì)胞系的培養(yǎng)和鑒定
　　 在37℃，5％CO2，正常氧濃度，飽和濕度條件下，10％的胎

3、牛血清，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)T3細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。Western blot檢測(cè)正常培養(yǎng)24小時(shí)的T3細(xì)胞中Akt、K-ras及p-53蛋白的表達(dá)情況。
　　 2、T3細(xì)胞系增殖的檢測(cè)
　　 （1）用0.25％的胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，懸浮于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。
　　 （2）以1×105/ml細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，分別加入含不同濃度姜黃素的DMEM培養(yǎng)液100μl，使姜黃素的終濃

4、度為10，20，40，80μmol/L。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組不加姜黃素只加培養(yǎng)液，空白對(duì)照組不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔；
　　 （3）培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清液，加入150μlDMSO溶液，震蕩培養(yǎng)板10min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm；細(xì)胞增殖抑制率（％）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組O

5、D值）]×100，求得IC50。以濃度為20μmol/L的Cur，分別作用0，6，12，24，48h，方法步驟同濃度組。
　　 3、T3細(xì)胞系遷移能力的檢測(cè)
　　 （1）細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，于無血清DMEM中培養(yǎng)12h后，PBS清洗3次，用1.5 ml、0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓將要從培養(yǎng)瓶壁脫落時(shí)，倒去多余的胰蛋白酶，加入3ml培養(yǎng)基，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹落并分散

6、成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml。
　　 （2）接種細(xì)胞： 將Transwell小室放入24孔板中，下室加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液500μl；取細(xì)胞懸液100μl加入上室，細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/孔，并按照實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)在上室加入藥物至終濃度組為0、20、40、80μmol/L，。（時(shí)間組以藥物濃度40μmol/L的Cur分別作用0、6、12、24h，每個(gè)樣本設(shè)置3次重復(fù)。
　　 （3）培養(yǎng)

7、細(xì)胞：37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24h。
　　 （4）固定及染色：取出Transwell小室，PBS輕輕沖洗，上下各沖洗1次；用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞；甲醇室溫下固定15min，蘇木素染液染色40 min，蒸餾水沖洗。
　　 （5）鏡檢：在倒置顯微鏡下（200×）對(duì)遷移至微孔膜下層的細(xì)胞計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，取均數(shù)。
　　 4、Western Blot檢測(cè)Cur作用后T3細(xì)胞系相關(guān)

8、蛋白表達(dá)
　　 提取T3細(xì)胞蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白濃度；蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳；免疫印跡法；蛋白印跡的分析。
　　 5、檢測(cè)分別加入PI3K特異性抑制劑LY294002和姜黃素以及二者共同做用后T3細(xì)胞系中p-Akt蛋白的表達(dá)
　　 Western blot檢測(cè)在引入PI3K特異性抑制劑LY294002（終濃度為20μmol/L）后，分別比較了空白組，Cur組（終濃度為20μmol/L），LY294002組，以及C

9、ur和LY294002聯(lián)合作用組作用后，p-Akt蛋白的表達(dá)水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、T3細(xì)胞系的培養(yǎng)和鑒定
　　 倒置顯微鏡下觀察T3細(xì)胞系的形態(tài)：正常狀態(tài)下，T3腫瘤細(xì)胞系約6小時(shí)貼壁，培育24小時(shí)后，癌細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，形態(tài)為橢圓形，菱形等呈巢團(tuán)狀排列，彌漫性分布，生長(zhǎng)旺盛。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示Akt，K-ras正常表達(dá)而p53蛋白的表達(dá)缺失，證實(shí)T3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在傳代培養(yǎng)后，基因

10、特征表達(dá)穩(wěn)定。
　　 二、姜黃素對(duì)T3細(xì)胞系增殖的影響
　　 以不同濃度梯度的Cur作用于T3細(xì)胞系，當(dāng)濃度為20μmol/L時(shí)，其對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率為43.17％，已接近50％，其增殖抑制率明顯高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)濃度為40μmol/L時(shí)，其增殖抑制率達(dá)到87.61％（P<0.01）；在0-48小時(shí)期間，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Cur對(duì)T3細(xì)胞系增殖抑制率逐漸增強(qiáng)，并具有時(shí)間依賴性。
　　 三、

11、姜黃素對(duì)T3細(xì)胞系遷移能力的影響
　　 不同濃度梯度的Cur可對(duì)T3細(xì)胞系的遷移能力產(chǎn)生影響。隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少，細(xì)胞遷移能力有所下降，在藥物濃度為20μmol/L時(shí)，細(xì)胞遷移抑制率為51.54％，藥物濃度為40μmol/L和80μmol/L時(shí)，細(xì)胞遷移抑制率分別達(dá)到75.11％和80.38％，同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)變圓、狀態(tài)變差的情況。在40μmol/L藥物濃度，作用時(shí)間24h細(xì)胞遷移能力明顯下降（P<0.05），隨

12、著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞遷移能力逐漸減弱。
　　 四、姜黃素作用下T3細(xì)胞系中Akt、K-ras、p-Akt、PI3K蛋白表達(dá)的變化
　　 本研究應(yīng)用Western blot檢測(cè)培養(yǎng)0、6、12、24小時(shí)，在濃度為20μmol/L的Cur作用下，T3腫瘤細(xì)胞系中Akt及其活化形式磷酸化Akt（p-Akt）、K-ras、PI3K.蛋白的表達(dá)水平。檢測(cè)結(jié)果表明，p-Akt表達(dá)水平，具有時(shí)間依賴效應(yīng)，其在0小時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，12小時(shí)表達(dá)明

13、顯減弱，24小時(shí)表達(dá)基本消失，光密度值相對(duì)比值進(jìn)行比對(duì)分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Akt在各時(shí)間組中的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化（P>0.05）。K-ras的表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減弱；而各時(shí)間組的表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。PI3K的表達(dá)水平0小時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，6小時(shí)稍弱，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸減弱。
　　 五、分別加入PI3K特異性抑制劑LY294002和姜黃素以及二者共同作用后T3細(xì)胞系中p-Akt

14、蛋白的表達(dá)
　　 Western blot檢測(cè)在引入PI3K特異性抑制劑LY294002（終濃度為20μmol/L）后，分別比較了空白組，Cur組（終濃度為20μmol/L），LY294002組，以及Cur和LY294002聯(lián)合作用組作用后，p-Akt蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明，單獨(dú)應(yīng)用姜黃素或LY294002，都會(huì)對(duì)p-Akt蛋白的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，且姜黃素組的抑制水平高于LY294002組，而二者共同作用下，對(duì)p-Akt蛋白的