熒光假單胞菌2P24抗生素2,4-DAPG合成基因的相關(guān)調(diào)控基因phlG的克隆及功能分析.pdf

1、隨著人們對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的認(rèn)識(shí)及對(duì)化學(xué)農(nóng)藥副作用的認(rèn)識(shí)，使植物病害生物防治的研究逐漸得到重視，生物防治以其特有的防治潛力已經(jīng)成為保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要手段，其中熒光假單胞菌可作為一種對(duì)植物病害有較高防治效果的生防制劑，在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中可以提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率和植物產(chǎn)品品質(zhì)，因此具有一定的發(fā)展前景。許多國(guó)家均有報(bào)道熒光假單胞桿菌可防治多種植物病害，其防病機(jī)制主要是產(chǎn)生某些次生代謝物質(zhì)，其中抗生物質(zhì)2,4-二乙?；g苯三酚（簡(jiǎn)稱2,4-DAPG或p

2、hl）的研究越來(lái)越受到重視。本文以我國(guó)小麥全蝕病自然衰退土壤中分離得到的生防假單胞菌株2P24（Pseudomonads fluorescens）為研究材料，對(duì)其2,4-DAPG代謝調(diào)控系統(tǒng)中的phlG基因進(jìn)行解析。
　　由于抗生素2,4-DAPG合成基因簇phlACBD上游的phlG基因相關(guān)資料報(bào)道較少，且菌株2P24的phlG與已報(bào)道P. fluorescens CHA0的phlG氨基酸同源性很低，僅為58.57％，無(wú)法推測(cè)菌

3、株2P24的phlG基因與2,4-DAPG合成，轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝的關(guān)系。為了解析phlG基因的功能，本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建菌株2P24的phlG基因內(nèi)缺失突變體，并利用薄層層析法和液相色譜法檢測(cè)突變菌株2，4-DAPG和MAPG的變化。試驗(yàn)中還解析了GacS、RsmE基因與phlG基因的調(diào)控關(guān)系，并測(cè)定突變菌株在小麥根部的定殖情況及對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響；研究了2,4-DAPG產(chǎn)生菌與不同種類生防菌混合定殖情況。
　　對(duì)2,4-DAPG產(chǎn)生菌株2P2

4、4的phlG基因突變菌進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定、平板拮抗測(cè)定和β-半乳糖苷酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，phlG基因缺失后不影響菌株2P24生長(zhǎng)速度，同時(shí)也不影響2,4-DAPG的正常表達(dá)。薄層層析試驗(yàn)中我們對(duì)比發(fā)現(xiàn)，phlG基因與2,4-DAPG降解相關(guān)，是調(diào)控2,4-DAPG降解的重要因子。其次，利用液相色譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)，2,4- DAPG降解后生成了其合成前體MAPG。另外，我們還發(fā)現(xiàn)phlG基因的缺失只是減緩了2,4- DAPG的降解速度，據(jù)此推測(cè)菌株2P2

5、4中仍存在其他調(diào)控降解2,4- DAPG的基因。為了進(jìn)一步檢測(cè)其他重要因子對(duì)phlG基因的表達(dá)影響，試驗(yàn)中構(gòu)建了菌株2P24phlG基因的LacZ融合子，并分別缺失 GacS基因和RsmE基因，通過(guò)β-半乳糖苷酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn) GacS基因?qū)?phlG基因的表達(dá)起正調(diào)控作用，RsmE基因則負(fù)調(diào)控phlG基因的表達(dá)。
　　本試驗(yàn)中還對(duì)phlG基因突變后細(xì)菌的定殖能力進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)phlG基因突變后不改變生防菌定殖能力。生防菌混合定殖試驗(yàn)