人類線粒體基因組遺傳變異在精子生成中的作用及其機(jī)制.pdf

1、不孕不育是生殖健康領(lǐng)域一項(xiàng)亟需解決的重大科學(xué)問題。育齡夫婦中約10-15％存在不同程度的生育障礙。導(dǎo)致不孕不育的原因很多，其中男方因素約占50％。前人研究表明，在過去的半個(gè)世紀(jì)里，男性精液質(zhì)量顯著下降，精子生成障礙已成為男性不育最常見的病因之一。精子生成障礙可能與環(huán)境化學(xué)污染物、遺傳因子改變、表觀遺傳修飾異常等密切相關(guān)。大約30％的精子生成障礙患者是由于遺傳學(xué)的異常引起的。線粒體作為細(xì)胞核外唯一含有遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器，其參與的氧化磷酸化過

2、程為精子生成、分化及活力維持提供所必需的能量。而且線粒體參與多種生物學(xué)過程，在ROS(Reactive Oxygen Species)平衡、細(xì)胞凋亡以及多種信號通路調(diào)節(jié)中都具有重要作用。線粒體基因組(Mitochondrial DNA，mtDNA)編碼氧化磷酸化體系的蛋白亞基和其自身的RNA翻譯元件，mtDNA變異會(huì)導(dǎo)致線粒體功能改變，進(jìn)而引起精子生成障礙，導(dǎo)致男性不育。目前關(guān)于mtDNA遺傳變異對精子生成或精液質(zhì)量的影響已有相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

3、然而由于受到mtDNA變異檢測技術(shù)、樣本量大小以及種群差異等多種因素的限制，線粒體基因組遺傳變異對精子生成的影響也不盡相同。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：人類線粒體基因組遺傳變異在非梗阻性無精癥(NOA)發(fā)生中的作用。
　　目的：為了闡明人類線粒體基因組在非梗阻性無精癥(NOA)中的作用，我們對NOA不育男性與健康生育對照的線粒體全基因組進(jìn)行測序，篩選與精子生成障礙相關(guān)的線粒體DNA遺傳變異，并在大樣本人群中進(jìn)一步確認(rèn)

4、。
　　方法：采用兩階段病例對照研究。第一階段，應(yīng)用高通量測序技術(shù)對96例無精癥病例和96例對照進(jìn)行mtDNA全測序，鑒定mtDNA單倍群，篩選出常見mtDNA單倍群以及與精子生成障礙相關(guān)的mtDNA遺傳變異。第二階段，針對536例無精癥病例和489例對照，利用SnaPshot測序技術(shù)，基于13個(gè)東亞地區(qū)常見單倍群的編碼區(qū)特征突變點(diǎn)分型結(jié)果，分析人群遺傳背景。隨后，利用SNPscan測序技術(shù)，對測序階段篩選出的遺傳變異進(jìn)行驗(yàn)證。為

5、了進(jìn)一步闡明線粒體遺傳變異導(dǎo)致的線粒體損傷的機(jī)制，我們應(yīng)用總抗氧化能力(total antioxidant capability,T-AOC)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒檢測并比較病例和對照以及不同單倍群之間精漿抗氧化能力。
　　結(jié)果：根據(jù)第一階段測序所得的線粒體DNA全序列，鑒定每個(gè)個(gè)體mtDNA單倍群分型，結(jié)合mtDNA系統(tǒng)發(fā)生樹以及東亞地區(qū)常見單倍群，篩選了13個(gè)東亞地區(qū)常見

6、單倍群及其定義位點(diǎn)，對比了病例和對照兩組間的遺傳背景。同時(shí)篩選了10個(gè)線粒體DNA潛在的功能性遺傳變異位點(diǎn)，包括6個(gè)編碼區(qū)的可能導(dǎo)致非同義突變的遺傳變異(m.3394T＞C，m.6881A＞G，m.8684C＞T, m.11696G＞A，m.12358A＞G，m.13135G＞A)，1個(gè)遺傳變異位于tRNA基因上(m.15968T＞C)，另外3個(gè)遺傳變異位于第一高變區(qū)(HVRI)(m.16224T＞C，m.16319G＞A，m.1649

7、7A＞G)。對第二階段大樣本獨(dú)立人群的遺傳背景進(jìn)行分析，結(jié)果提示單倍群M8*在病例組的比例顯著高于對照組(OR2.61，95％ CI1.47-4.61)(P=6.76×10-4)，提示單倍群M8*會(huì)增加精子生成障礙的風(fēng)險(xiǎn)。此外，在獨(dú)立人群中驗(yàn)證潛在遺傳變異位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)m.8684C＞T在病例組中顯著高發(fā)(OR4.14，95％ CI1.56-11.03)(P=2.09×10-3)，提示m.8684C＞T同樣會(huì)增加精子生成障礙的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)

8、由于m.8684C＞T是單倍群M8a的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，因此，我們進(jìn)一步提出假設(shè)，遺傳背景單倍群M8a導(dǎo)致了遺傳變異m.8684C＞T在無精癥人群中富集。為了驗(yàn)證上述假設(shè)，我們進(jìn)一步分析單倍群M8*的2個(gè)亞單倍群，M8a和Z，比較單倍群M8a和單倍群Z在病例和對照之間的分布，發(fā)現(xiàn)單倍群M8a在病例組中的比例顯著高于對照組(OR4.14，95％ CI1.56-11.03)(P=2.09×10-3)，而單倍群Z在兩組間的分布并無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

9、OR1.86，95％ CI0.92-3.77)(P=7.88×10-2)。結(jié)果提示，遺傳背景單倍群M8a導(dǎo)致了遺傳變異m.8684C＞T在無精癥人群中富集，增加了其導(dǎo)致精子生成障礙的風(fēng)險(xiǎn)。為進(jìn)一步研究線粒體遺傳變異致線粒體損傷的水平，我們對精漿抗氧化能力進(jìn)行檢測。與對照組相比，病例組T-AOC顯著下降(P＜0.05)，提示病例組線粒體功能受損，而SOD活性沒有差異。在不同單倍群之間，由于樣本量的限制，T-AOC和SOD并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異

10、。
　　結(jié)論：遺傳背景單倍群M8a導(dǎo)致了遺傳變異m.8684C＞T在無精癥人群中富集，增加了其導(dǎo)致精子生成障礙的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，mtDNA遺傳變異可導(dǎo)致精漿抗氧化能力下降，提示線粒體損傷，從而能夠引起精子生成障礙。
　　第二部分：人類線粒體基因組遺傳變異在少弱精癥發(fā)生中的作用。
　　目的：為了全面研究線粒體基因組與少弱精癥病因?qū)W之間的關(guān)聯(lián)，通過深度測序線粒體全基因組，篩選與精液質(zhì)量下降相關(guān)的線粒體DNA遺傳變異，并在獨(dú)立人

11、群中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法：采用兩階段病例對照研究。篩選階段，采用下一代測序技術(shù)對233例少弱精癥病例和233例對照進(jìn)行mtDNA全測序。鑒定樣本單倍群并分析主要單倍群分布。隨后，篩選與少弱精癥相關(guān)的線粒體基因組遺傳變異位點(diǎn)。驗(yàn)證階段，針對688例少弱精癥患者及533例對照，利用SNaPshot測序方法，基于13個(gè)東亞地區(qū)常見的單倍群定義位點(diǎn)分型結(jié)果，分析mtDNA單倍群遺傳背景。利用SNPscan測序技術(shù)，對測序階段篩選的遺傳變異

12、進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：根據(jù)篩選階段測序所得的線粒體DNA全序列，鑒定樣本單倍群并整合入13個(gè)東亞地區(qū)常見單倍群，分析少弱精癥和對照兩組的單倍群分布，結(jié)果符合東亞特有mtDNA單倍群的頻率分布。同時(shí)篩選出7個(gè)可能增加精液質(zhì)量下降的風(fēng)險(xiǎn)的遺傳變異位點(diǎn)。其中，4個(gè)位點(diǎn)位于編碼區(qū)(m.12338T＞C，m.12361A＞G，m.13928G＞C和m.A15235 A＞G)，1個(gè)位點(diǎn)位于tRNA(m.5601C＞ T)，2個(gè)位點(diǎn)位于第一高變

13、區(qū)(m.16179 C＞T和m.16291 G＞A)。對驗(yàn)證階段大樣本獨(dú)立人群的遺傳背景進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)少弱精癥組和對照組兩組間線粒體單倍群分布沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示兩組間遺傳背景的一致性。此外，通過獨(dú)立人群的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，位于第一高變區(qū)(HVS-Ⅰ)的潛在遺傳變異位點(diǎn)m.16179 C＞T與少弱精癥顯著相關(guān)(OR3.10，95％ CI1.41-6.79)(P=3.10×10-3)。為了進(jìn)一步闡明線粒體遺傳變異對精液質(zhì)量的影響，我們分析了精子密

14、度和精子活力兩個(gè)指標(biāo)。m.16179 C＞T和m.12361 A＞G能顯著增加少精癥的風(fēng)險(xiǎn)，P值分別為1.90×10-4(OR4.18;95％ CI1.86-9.40)和5.50×10-3(OR3.30;95％ CI1.36-8.04)。m.16179 C＞T同時(shí)能顯著增加弱精癥的風(fēng)險(xiǎn)(OR3.17;95％ CI1.40-7.16)(P=3.50×10-3)。
　　結(jié)論：線粒體DNA遺傳變異m.16179 C＞T和m.12361

15、A＞G可以增加少弱精癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　第三部分：少弱精癥的線粒體基因組拷貝數(shù)變異研究。
　　目的：通過比較少弱精癥與健康生育男性對照精子mtDNA拷貝數(shù)水平，分析mtDNA含量與精液質(zhì)量的關(guān)系，探討導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)差異的可能原因
　　方法：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，采用相對定量的方法，檢測100例少弱精癥病例和80例正常對照的精子mtDNA拷貝數(shù)。
　　結(jié)果：少弱精癥組的平均mtDNA拷貝數(shù)79.02±1