花絨寄甲線粒體基因組與合成調控基因及其COXI基因的種群遺傳結構研究.pdf

1、花絨寄甲（Dastarcus helophoroides）屬鞘翅目寄甲科（Coleoptera: Bothrideridae），是各類天牛的重要天敵。線粒體是細胞及生命體活動所需能量的主要來源，其擁有分子量相對較小、突變率高、呈母系遺傳及在細胞中拷貝數(shù)量多等眾多特點，常被用于譜系地理學、種群遺傳學、種系發(fā)生、分了進化和比較進化基因組學等方面的研究。線粒體編碼基因不能獨立完成氧化磷酸化產生ATP的過程，細胞核通過各種轉錄因子和輔酶因子對線

2、粒體基因進行調控。本文通過長片段PCR-步移測序法研究了花絨寄甲線粒體基因組全序列，得到了其序列全長并對其所包含的分子生物學信息進行了詳細分析;在線粒體基因組全序列的基礎上，研究基于COXI基因的不同種群花絨寄甲的種群遺傳結構和遺傳差異;利用花絨寄甲轉錄組數(shù)據，對調控線粒體生物合成的AMPK基因和PGC-1α信號通路基因進行了篩選、鑒定和實時定量表達分析。分析結果如下:
　　1)花絨寄甲線粒體基因組全長序列為15878bp(Gen

3、Bank:KF811054.1)，由13個蛋白質編碼基因(PCGs)、22個tRNA基因、2個rRNA基因和非編碼區(qū)（D-loop環(huán)）組成的。除了COⅠ基因擁有非規(guī)范的起始密碼子，其他PCGs均以ATN密碼子起始并以TA(A)或TAG密碼子終止。rmL和rmS的二級結構分別由48個螺旋（包含四個新提出的螺旋）和35個螺旋（包含兩個新提出的螺旋）構成。除trnS1(AGN)因缺少二氫尿嘧啶臂（DHU臂）不能形成穩(wěn)定的莖-環(huán)結構外，其余21

4、個tRNAs均能折疊成典型的三葉草型二級結構。運用蛋白質編碼基因的核苷酸和氨基酸數(shù)據集分別分析物種間的系統(tǒng)發(fā)育關系結果表明，花絨寄甲屬于鞘翅目扁甲總科的寄甲科，與形態(tài)學分類結果一致。為探索種群遺傳結構、種系鑒定以及花絨寄甲的進化和種系發(fā)生提供有效的分子生物學基礎信息。
　　2)通過COXI基因研究不同寄主花絨寄甲種群的遺傳學關系，共得到具有51個核苷酸多態(tài)性位點的26個單倍型，種群間遺傳多樣性指數(shù)較低，遺傳變異主要發(fā)生在種群內部。

5、種群間存在較低的遺傳分化系數(shù)和較高的基因流動，表明種群間的基因交換明顯。共有單倍型DH01是祖先的單倍型，其他單倍型通過不同的突變從其進化而來。在五個種群之間，特別是在群體AG、MA和MR之間基岡交換程度較高，表明在野外這些種群之間可能存在交叉混合。為花絨寄甲遺傳差異提供了理論基礎，同時也為有效利用天敵進行生物學防治提供了分子生物學佐證。
　　3)通過花絨寄甲轉錄組文庫篩選和RACE擴增，得到3條花絨寄甲AMPK基因的cDNA序列

6、全長。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，花絨寄甲AMPK亞基與其他昆蟲相應序列的同源性較高，尤其與鞘翅目的赤擬谷盜的同源性達到85％以上。通過實時定量qPCR，發(fā)現(xiàn)在不同處理條件下均檢測到AMPK基因的表達，且表達水平存在顯著的差異性。3條AMPK基因均表現(xiàn)為在雄性生殖系統(tǒng)和脂肪體中表達相對較高;在一齡幼蟲和蛹中的表達量較高;隨著花絨寄甲存活時間的延長，各基因的表達有明顯的上升趨勢，可能與其應對環(huán)境變化和緩解衰老有關;在不同脅迫條件下，各基因在雌成蟲中

7、的表達量均高于雄成蟲，隨著處理時間的增加表現(xiàn)出先上升后降低的趨勢，顯示AMPK基因在昆蟲變態(tài)發(fā)育、壽命延伸和應激過程中發(fā)揮重要作用。
　　4)從花絨寄甲轉錄組文庫和線粒體基因組中篩選出PGC1-α、NRF1、mtTFA、COXI和ATP6基因，5條基因的氨基酸序列均表現(xiàn)出與其他物種相應氨基酸序列的同源性較高。實時熒光定量qPCR結果表明，5個線粒體合成基因的表達存在顯著的組織特異性和蟲態(tài)特異性:在花絨寄甲雄性生殖系統(tǒng)和脂肪體中的表