miR-204在前列腺增生中的表達和功能研究.pdf

1、第一部分 miR-204在前列腺增生中的表達和功能研究
　　良性前列腺增生癥(BPH)是老年男性常見病，由于它在泌尿系統所造成的梗阻，影響排尿，直接威脅腎功能，給患者的生活與健康帶來嚴重的危害，一直是國際上研究的重要課題之一。前列腺增生的發(fā)病機制至今仍不明了，但臨床研究與基礎研究都表明雄激素及其下游信號通路在前列腺增生中具有關鍵作用。miRNA是一組廣泛存在于真核生物中，不編碼蛋白質的長約20-24nt的小RNA分子，可通過與靶基

2、因的3'UTR完全或不完全匹配，降解靶基因或抑制其翻譯，從而參與調控個體發(fā)育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動。我們實驗室曾報道在前列腺癌LNCap細胞中miR-204的表達水平受雄激素的下調，并發(fā)現miR-204與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。鑒于我們課題組在前列腺癌中miR-204的表達和功能研究中取得的一定成果，我們推測在同樣受雄激素調控的前列腺增生的組織中，miR-204作為雄激素調控的下游基因參與了前列腺增生的發(fā)生和發(fā)展。我們成功

3、誘導了大鼠前列腺增生模型，并發(fā)現在雄激素水平逐漸增高的情況下，miR-204的表達水平降低。同時設置了去勢模型和氟他胺干預前列腺增生模型，在這兩種模型中，發(fā)現miR-204的表達水平與對照組相比明顯上調，進一步證實了miR-204的表達水平受雄激素的負調控。同時，我們檢測了miR-204的前體pre-miR-204、宿主基因TRPM3的表達變化，發(fā)現二者在不同模型里的變化趨勢與miR-204有相對平行關系。進一步我們運用生物信息學技術預

4、測miR-204的下游靶基因，在綜合三種靶基因預測軟件和國內外相關文獻報道的基礎上初步預測了FOXC1、PDEF、XRN1三種靶基因。結果顯示，在miR-204表達水平逐漸升高的去勢模型和氟他胺干預模型中，XRN1mRNA的表達含量逐漸降低;在miR-204表達水平逐漸降低的前列腺增生模型中XRN1的表達含量逐漸增高，而預測的其他靶基因表達水平變化無規(guī)律。進一步從蛋白水平進行檢測，發(fā)現在去勢模型和氟他胺干預模型中，XRN1蛋白含量有所降

5、低，而在前列腺增生模型中，XRN1蛋白含量隨著增生程度的加深有所增加。XRN1在mRNA和蛋白水平的表達變化結果充分證明了XRN1是miR-204的靶基因之一。實驗結果表明，miR-204可作為雄激素的下游調節(jié)基因，參與到前列腺增生的發(fā)生、發(fā)展過程中。我們將在后續(xù)實驗中進一步探索雄激素受體通過miR-204調控前列腺增生的機理。
　　第二部分人類HMGB4蛋白的表達純化和多克隆抗體的制備
　　高遷移率蛋白族(high mob

6、ility group，HMG) HMG蛋白，是真核細胞內繼組蛋白之后含量最為豐富的一組染色質蛋白質。研究表明HMG家族兼有染色質結構蛋白的功能和調節(jié)基因轉錄的功能。根據分子量大小、序列相似性和DNA結構特性，HMG可進一步分為HMGB、HMGA、HMGN3個家族。HMGB4是HMGB家族的一個新成員，我們實驗室已經開展了關于HMGB4的前期研究工作，初步的結果表明HMGB4是一種核仁蛋白，其表達具有相當高的睪丸組織特異性。本研究的目的

7、是制備人HMGB4的多克隆抗體，以方便后續(xù)用多種手段研究其功能。實驗中用PCR方法擴增人HMGB4的cDNA片段，克隆于融合蛋白表達載體pET-28a(+)并轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經IPTG誘導表達、蛋白純化、質譜鑒定后，成功表達了相對分子量為28000的人HMGB4融合蛋白。重組人HMGB4蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備兔抗血清?？寡褰浖兓蠼汦LISA檢測抗體效價達到1∶102400; Western blot、免疫