水稻種子內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性研究及一株新菌種的鑒定.pdf

1、本文首先對三個優(yōu)異雜交水稻（Oryza sativa L.）親本種子不同發(fā)育時期內(nèi)生細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究；然后對超級雜交水稻“深兩優(yōu)5814”種子內(nèi)生細(xì)菌多樣性通過培養(yǎng)方法結(jié)合可培養(yǎng)方法進(jìn)行了研究；最后對從水稻種子分離的一株潛在新種進(jìn)行了鑒定。所得結(jié)果如下：
　　通過采用分離培養(yǎng)方法，對優(yōu)異雜交水稻親本“深08S”、“和620S”、“16A007”灌漿期和成熟期的種子內(nèi)生細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究。從灌漿期和成熟期“深08S”種子中分別分

2、離得到98株和120株內(nèi)生細(xì)菌，分別有6個和40個OTUs，分別屬于兩大類群（變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes））和四大類群（變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）），各有5個和22個屬；從灌漿期和成熟期“和620S”種子中分別分離得到71株和75株內(nèi)生細(xì)菌，各有10個和20

3、個OTUs（operational taxonomic units，分類操作單元），分別屬于兩大類群（變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria））和三大類群（變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）），各有5個和12個屬；從灌漿期和成熟期“16A007”種子中分別分離得到82株和100株內(nèi)生細(xì)菌，分別有11個和24個 OT

4、Us，各屬于一個類群（變形菌門（Proteobacteria））和三大類群（變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）），分別有6個和14個屬。對結(jié)果進(jìn)行比較和分析，發(fā)現(xiàn)三個品種水稻種子兩個發(fā)育時期的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化均較明顯，種子成熟期細(xì)菌種類較豐富，且細(xì)菌優(yōu)勢種類不同?！吧?8S”灌漿期的優(yōu)勢菌屬為泛菌屬（Pantoea；豐度52.04％）、假單胞菌屬（Ps

5、eudomonas；31.63%）及根瘤菌屬（Rhizobium；10.20%）；而成熟期的優(yōu)勢菌屬為根瘤菌屬（Rhizobium；15.83%）、芽孢桿菌屬（Bacillus；14.99%）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas；9.17%）及短桿菌屬（Curtobacterium；9.17%）?！昂?20S”灌漿期的優(yōu)勢菌屬為泛菌屬（Pantoea；69.02%）、假單胞菌屬（Pseudomonas；18.32%）、根瘤菌屬（Rh

6、izobium；5.64%）及鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas；5.64%）；而成熟期的優(yōu)勢菌屬為短桿菌屬（Curtobacterium；25.33%）、微桿菌屬（Microbacterium；15.99%）及泛菌屬（Pantoea；11.99%）。“16A007”灌漿期的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas；45.12%）、泛菌屬（Pantoea；41.46%)及鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas；6.10%）；而

7、成熟期的優(yōu)勢菌屬為泛菌屬（Pantoea；35.00%）、微球菌屬（Micrococcus；11.00%）及假單胞菌屬（Pseudomonas；8.00%）。
　　對超級雜交水稻“深兩優(yōu)5814”種子內(nèi)生細(xì)菌構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫的非培養(yǎng)方法，結(jié)果表明來自種子內(nèi)生細(xì)菌的180個陽性克隆屬于13個OTUs， Proteobacteria在克隆文庫中所占比例最大，為99.44%（179克?。?；此外還有極少量克隆與Actino

8、bacteria（1克隆,0.56%）類群的細(xì)菌同源。該群落優(yōu)勢菌屬（豐度）為Pantoea（89.44%）、Flavobacterium（3.30%）及Methylobacterium（3.30%）；Proteobacteria是種子的優(yōu)勢類群，其他類群所占比例很小。
　　通過采用可培養(yǎng)方法對“深兩優(yōu)5814”種子內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)一步分析，結(jié)果表明：從種子中分離到200株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌屬于49個OTUs，分屬Firmicutes、Pr

9、oteobacteria和Actinobacteria三大類群，所占比例分別為56.5%、35.5%和8.0%；第一優(yōu)勢菌屬為Bacillus（37.5%），第二優(yōu)勢菌屬為Fictibacillus（12.5%）， Pantoea（7.5%）和Klebsiella（7.5%）并列第三優(yōu)勢菌屬。可以看出“深兩優(yōu)5814”種子內(nèi)生細(xì)菌豐富。與采用構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫的非培養(yǎng)方法相比，傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)方法分離獲得的種子內(nèi)生細(xì)菌種

10、類更多，內(nèi)生細(xì)菌群落更具有多樣性。兩種方法獲得的優(yōu)勢菌屬及豐度均存在一定差異，兩者的聯(lián)合使用及其對結(jié)果的綜合分析能夠獲得種子內(nèi)生細(xì)菌客觀與全面的區(qū)系分析結(jié)果。
　　對從水稻種子中分離的一株潛在新種Z8T進(jìn)行表型特征、生理生化特征、遺傳型特征、化學(xué)類特征的多相分類鑒定。菌株Z8T菌落顏色淺橙色，細(xì)胞呈卵圓形或橢圓形，無性生殖方式為出芽生殖，無子囊孢子。菌株可利用的碳源有葡糖糖、D-甘露糖、D-甘露醇、D-麥芽糖、D-纖維二糖、D-果

11、糖、D-阿拉伯糖、菊糖、糖原、葡萄糖酸鉀、2-酮基葡糖酸、5-酮基葡糖酸、淀粉。菌株可利用的氮源有亞硝酸鹽、硝酸鹽。26S rDNA D1/D2區(qū)和ITS區(qū)序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株Z8T歸類于Microsporomyces屬。Z8T基因組DNA的G+C含量為56.7 mol%，泛醌為Q10?；诒硇吞卣鳌⑸砩?、遺傳學(xué)上存在的差異，將菌株Z8T鑒定為Microsporomyces屬的新種，并命名為Microsporomyces