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文檔簡介
1、大量研究證實,綠肥是保持和提高土壤肥力和質(zhì)量的有效措施之一,雖然已有綠肥對土壤微生物影響的相關(guān)研究報道,但由于所用方法和技術(shù)所限,相關(guān)研究既不系統(tǒng)也不深入,特別是綠肥對水稻根內(nèi)生細(xì)菌影響研究尚屬空白。 本課題以湖南祁陽農(nóng)田系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站具有28年(1982-2010)長期定位歷史的稻一稻一紫云英豆科綠肥及稻-稻-冬閑輪作水稻根為材料,采用基于16S rDNA為基礎(chǔ)的先進分子生態(tài)學(xué)方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相結(jié)合,深入系統(tǒng)研究紫云英綠
2、肥輪作水稻根內(nèi)生微生物多樣性。
本研究同時將針對性地分離培養(yǎng)微生物類群,對可培養(yǎng)微生物溶磷性,產(chǎn)植物生長素(IAA),產(chǎn)鐵載體,拮抗及固氮酶活性等促生功能研究。
通過培養(yǎng)方法檢測水稻根內(nèi)生微生物數(shù)量,結(jié)果表明:稻-稻-紫云英綠肥輪作系統(tǒng)水稻根中微生物平均數(shù)量為7.75×106cfu·g-1鮮土,比稻-稻-冬閑高78.17%。通過傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)方法從稻-稻-冬閑和稻-稻-紫云英水稻根中分別分離77株和169株
3、細(xì)菌。對246株細(xì)菌溶磷、分泌生長素(IAA)及分泌鐵載體的功能進行了初步測定,結(jié)果表明稻-稻-紫云英內(nèi)生細(xì)菌具有溶解無機磷活性、溶解有機磷活性、分泌生長素(IAA)能力及產(chǎn)鐵載體能力菌株分別為139、12、72、73株,稻-稻-冬閑分別為67、8、40、57株。其中菌株ZYY43的溶磷活性最高;菌株ZYY170產(chǎn)IAA能力最高,為419.17ug/mL;菌株DX78分泌鐵載體能力最強,達到了“++++”的水平。
在上述研
4、究基礎(chǔ)上選取48株菌進行拮抗試驗,結(jié)果顯示,3株菌對棉花紅腐病菌(Fusarium moniliforme ACCC36127)有抑制作用,其中的2株對水稻白葉枯病菌(Xanthomonascampestris pv.oryzae ACCC05509)有抑制作用。固氮酶活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌株DX35的固氮酶活性最高為181.21nmolC2H4/mg protein hr,為參比菌株圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcu
5、m ACCC10006)的10倍左右,在固氮菌肥開發(fā)方面具有非常大的應(yīng)用潛力。并在此基礎(chǔ)上利用大試管和盆栽水稻促生試驗的方法篩選10株兼具多種促生功能的優(yōu)良菌株,菌株ZYY5、ZYY10和ZYY136準(zhǔn)備進行田間試驗。
采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對稻-稻-紫云英和稻-稻-冬閑水稻根內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌群落多樣性進行研究。用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ和RsaⅠ聯(lián)合酶切,獲得246株菌酶切指紋圖譜。結(jié)果表明,HaeⅢ和Rsa
6、Ⅰ聯(lián)合酶切產(chǎn)生了23個基因分型,單一酶切產(chǎn)生的基因分型少。16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,分離得到的77株稻,稻冬閑細(xì)菌分屬14屬15個種,分離得到的169株稻,稻紫云英細(xì)菌分屬19屬21個種。兩個樣品中細(xì)菌群落大多數(shù)為變形菌綱(Proteobacteria)。其中β-變形菌綱(β-proteobacteria)占據(jù)優(yōu)勢地位,其次為γ-變形菌綱(γ-proteobacteria),其他分屬α-變形菌綱(α-proteobacter
7、ia)及厚壁菌門(Firmicutes)。放線菌門(Actinobacteria)只存在于稻-稻-紫云英水稻根內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌中。其中Herbaspirillum和Cedecea為兩個處理中分離到的共有優(yōu)勢種群,而稻-稻-紫云英水稻根內(nèi)生細(xì)菌中的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia),假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和泛菌屬(Pantoea)也為分離到的優(yōu)勢種群,且在稻-稻-紫云英水稻根
8、這一特殊的生存空間中有1株潛在的根瘤菌屬(Rhizobium)新種存在。
可培養(yǎng)的細(xì)菌中,編號為ZYY136菌株其16S rDNA基因序列在NCBI Blast中比對發(fā)現(xiàn)與根瘤菌屬(Rhizobium)的Rhizobium alkalisoli(CCBAU01393)的同源性最高,為96.174%。以近緣菌株CCBAU01393(Rhizobium alkalisoli)和SO2(Rhizobium huautlense)
9、為參比菌株,采用多相分類方法,對其形態(tài)學(xué)特征、唯一碳氮源利用、脂肪酸組成成分分析(MIDI)、ERIC-PCR和BOX-PCR指紋圖譜分析、16S rDNA全序列分析及atpD、gltA、gyrB、recA、rpoB、thrC持家基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進行分析。實驗結(jié)果初步證實,ZYY136菌株為根瘤菌屬(Rhizobium)的一個新種。
利用細(xì)菌通用引物,對從2個水稻根樣品中提取總DNA進行16S rDNA基因的PCR擴增,
10、構(gòu)建克隆文庫對PCR產(chǎn)物進行分析,結(jié)果顯示,2個水稻根樣品中細(xì)菌群落大多數(shù)為變形菌綱(Proteobacteria)。其中β-變形菌綱(β-proteobacteria)占據(jù)優(yōu)勢地位,其次為α-變形菌綱(α-proteobacteria)和δ-變形菌綱(δ-proteobacteria),其他分屬及厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Acidobacteria)等,但在所占比例上有較大區(qū)別
11、。且(Armatimonadetes)在稻-稻-冬閑模式(DX)水稻根中存在,而稻-稻-紫云英豆科綠肥還田(ZYY)處理中沒有被發(fā)現(xiàn)。其中伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)和根瘤菌(Bradyrhizobium)為兩個處理中分離到的共有優(yōu)勢種群,而其數(shù)量在稻-稻-紫云英水稻根內(nèi)分布較高。
純培養(yǎng)方法從稻-稻-冬閑和稻-稻-紫云英水稻根樣品中得到的細(xì)菌群落與克隆文庫構(gòu)建檢測到的群落多樣性相比,均發(fā)現(xiàn)2個水稻根樣品中細(xì)
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