薄殼山核桃遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建.pdf

1、薄殼山核桃（C.illinoensisK.Koch）又名美國(guó)山核桃、長(zhǎng)山核桃，胡桃科山核桃屬木本植物。薄殼山核桃樹體高大不利于人工采摘果實(shí)及日常的養(yǎng)護(hù)管理，矮化的砧木為育種工作及果品的推廣提供了便利。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，以植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育矮化且抗性提高的新品種具有非常重要的意義。目前，關(guān)于山核桃屬植物轉(zhuǎn)基因的報(bào)道較少，多數(shù)是將基因?qū)氲綌M南芥中來(lái)驗(yàn)證其功能，但是擬南芥與山核桃屬植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，并不能真實(shí)反映該基因在薄殼山核桃

2、中的真正功能。以體細(xì)胞胚作為轉(zhuǎn)基因受體材料具有操作簡(jiǎn)便、周期短、基因轉(zhuǎn)化率高等許多優(yōu)點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)以體胚為受體材料構(gòu)建薄殼山核桃遺傳轉(zhuǎn)化體系。
　　本研究首先對(duì)薄殼山核桃體胚的成熟與萌發(fā)條件進(jìn)行優(yōu)化，再采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將具有矮化功能的赤霉素基因GA20ox轉(zhuǎn)入薄殼山核桃體胚中，探索能成功構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系的條件，為今后更好的導(dǎo)入目的基因奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.薄殼山核桃體胚成熟脫水最佳時(shí)間為5天，經(jīng)過(guò)干燥脫

3、水5天的體胚發(fā)芽率最高，達(dá)66.3％。
　　2.通過(guò)調(diào)節(jié)SOD、POD、CAT活性及MDA含量，促進(jìn)薄殼山核桃體細(xì)胞胚的發(fā)育成熟。經(jīng)過(guò)0-5天的干燥，POD、CAT和MDA含量都有所增加，之后第6天都下降。經(jīng)過(guò)0-6天的干燥，SOD酶活性顯著降低。
　　3.采用ELISA法測(cè)定體胚成熟過(guò)程中內(nèi)源激素含量變化。在體胚成熟過(guò)程中，ABA和IAA含量的影響較GA3和ZR大，總體來(lái)看GA3和ZR對(duì)其成熟與萌發(fā)的作用不大。脫水第5天時(shí)

4、，子葉胚內(nèi)ABA含量達(dá)到最大值110.75 ng/g·fw，第3天時(shí)IAA含量達(dá)到頂峰為101.78 ng/g·fw。
　　4.在抗生素選擇壓的確定上，分別從Cerb和Hyg兩個(gè)因素進(jìn)行了研究，與潮霉素相比，體胚對(duì)卡那霉素有更強(qiáng)的抗性。將Cerb的濃度設(shè)置為0mg·L-1，200mg·L-1，250mg·L-1，300mg·L-1和350mg·L-1，Hyg的濃度設(shè)置為0mg·L-1，60mg·L-1，80mg·L-1，100mg

5、·L-1和120mg·L-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:體胚分別放到只含300mg·L-1Cerb和100mg·L-1Hyg的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后，體胚生長(zhǎng)明顯受到抑制并且停止了增殖，故選擇300mg·L-1Cerb和100mg·L-1Hyg作為薄殼山核桃抗性體胚篩選的篩選劑濃度。
　　5.對(duì)農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)薄殼山核桃體胚轉(zhuǎn)基因體系中的菌液濃度進(jìn)行了篩選。在侵染時(shí)間為15min，共培養(yǎng)3天相同的條件下，比較在侵染液中分別加入濃度OD6

6、00=0.05，0.2，0.5，0.8的農(nóng)桿菌菌液的轉(zhuǎn)化效率。菌液濃度OD600=0.5時(shí)非抗性體胚率為30.49％，GUS瞬間表達(dá)率達(dá)到58.27％。
　　6.對(duì)最適侵染時(shí)間進(jìn)行了研究，在OD600=0.5，共培養(yǎng)3天相同的條件下，侵染時(shí)間分別設(shè)為0min，10min，15min，20min。結(jié)果表明，當(dāng)侵染時(shí)間為15min時(shí)的非抗性體胚率雖比10min有所提高，但GUS瞬間表達(dá)率最高達(dá)到了61.52％。
　　7.將GA2

7、0ox的RNA干擾載體轉(zhuǎn)入薄殼山核桃體胚，經(jīng)過(guò)抗性體胚篩選與分化，進(jìn)行抗性體胚分子檢。用GA20ox基因的引物對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化得到的體胚進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所檢測(cè)的轉(zhuǎn)化體胚cDNA能擴(kuò)增出約232bp的條帶，初步證明外源基因已經(jīng)整合到薄殼山核桃轉(zhuǎn)化植物基因組中。然而其中還有部分轉(zhuǎn)化后體胚檢測(cè)呈陰性，這說(shuō)明在試驗(yàn)中產(chǎn)生了假轉(zhuǎn)化體，需要繼續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)化的單因素進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，同時(shí)還要尋找各個(gè)因素作用的最佳組合，最終提高轉(zhuǎn)化的效率。
　　8.對(duì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的