馬鈴薯原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物且用途廣泛，發(fā)展其生產(chǎn)具有重要的意義。近年來(lái)，馬鈴薯常規(guī)育種工作遇到了難以跨越的“生物學(xué)路障”，而基因工程技術(shù)對(duì)于轉(zhuǎn)移目標(biāo)性狀具有很大的目的性，已經(jīng)成為目前改良作物品性的重要手段。原生質(zhì)體作轉(zhuǎn)化受體較傳統(tǒng)外植體更能整合大片段DNA，但目前馬鈴薯這方面的研究還不夠充分。 本研究以馬鈴薯無(wú)性系8<'＃>（2n=4x=48）為材料，分離其葉肉原生質(zhì)體作轉(zhuǎn)化受體，選用綠色熒光蛋白（GFP）基因作為報(bào)告基因，采用

2、共孵育（原生質(zhì)體與質(zhì)粒DNA直接融合）法，PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和電擊穿孔轉(zhuǎn)化法，將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到馬鈴薯原生質(zhì)體中。通過(guò)轉(zhuǎn)化子中綠色熒光蛋白的表達(dá)，研究馬鈴薯原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。主要結(jié)果如下： 1．SK-gfp轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建從pBIN m-gfp5-ER（14.7kb）上酶切出gfp基因，裝入SK載體，構(gòu)建SK-gfp質(zhì)粒，長(zhǎng)度約4.8kb，gfp基因經(jīng)序列測(cè)定，與pBINm-gfp5-ER上gfp序列比對(duì)，相似性為100

3、％。 2．共孵育 即將一定濃度的外源DNA（60、80、100μg／mL）和純化后的原生質(zhì)體直接共培養(yǎng)，共得到163個(gè)愈傷組織，其中轉(zhuǎn)化子30個(gè)，轉(zhuǎn)化效率18.4％。 3．PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化純化后的原生質(zhì)體用PSL（甘露醇0.3mol／L，MgCL<,2>15mmol／L，MES0.1％，pH5.8，高溫滅菌）懸浮，加入一定濃度的質(zhì)粒DNA（75、100μg／mL），充分混勻后靜置片刻，然后均勻地滴于無(wú)菌培養(yǎng)皿的底部，靜置

4、3min，待大多數(shù)細(xì)胞沉降后，在每滴正上方加等量的12.5％或25％的PEG溶液，分別靜置10min或5min，誘導(dǎo)外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。共得到愈傷組織149個(gè)，有70個(gè)是轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率為47.0％，其中PEG（12.5％，10min）的轉(zhuǎn)化效率為51.9％，高于PEG（25％，5min）的44.2％，且二者之間在P=0.05水平上存在顯著性差異。 4．電擊穿孔轉(zhuǎn)化 電轉(zhuǎn)化儀：Eppendorf Multiporator

5、4308型，轉(zhuǎn)化室為250μL螺旋型鉑金電極，間距0.02cm；電轉(zhuǎn)化液的組成：0.35mol／L，甘露醇+0.1mMCaCl<,2>，pH5.8，高溫滅菌；脈沖電壓為20v，脈沖次數(shù)n=1。得到愈傷組織312個(gè)，其中轉(zhuǎn)化子183個(gè)，轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到58.7％。 5．比較外源DNA長(zhǎng)度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化和電擊穿孔轉(zhuǎn)化時(shí)，SK-gfp的轉(zhuǎn)化效率比pBINm-gfp5-ER的高；而在PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中出現(xiàn)了相反的情況

6、。 6．通過(guò)研究DNA濃度與轉(zhuǎn)化效率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：只有在共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)，DNA濃度為80μg／mL的轉(zhuǎn)化效率與60、100μg／mL的效率在P=0.05水平上存在顯著性差異，PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和電擊穿孔轉(zhuǎn)化時(shí)設(shè)立的兩濃度（75、100μg／mL）所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率不存在顯著性差異。 7．三種轉(zhuǎn)化方法共得到愈傷組織624個(gè)，其中轉(zhuǎn)化子283個(gè)。對(duì)三種轉(zhuǎn)化方法得到的轉(zhuǎn)化子效率比較得出，比較適宜的馬鈴薯原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法是電擊穿孔轉(zhuǎn)化法，