茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、本文構建了咖啡堿合成酶基因干涉表達載體，以茶樹(Cxmelliasinensiscv.)龍井-43組培苗葉片為外植體，研究了影響根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系因素。根據(jù)GUS染色情況，對影響農(nóng)桿菌侵染茶樹葉片效果的若干參數(shù)進行了優(yōu)化，以期為低咖啡堿茶樹品種培育提供一條新的途徑。檢測了野葛愈傷組織提取物清除自由基能力和抗氧化活性，為開發(fā)新型天然抗氧化劑提供了試驗依據(jù)。
　　 1.咖啡堿合成酶(Teacaffeinesynthase，

2、TCS)基因RNAi載體的構建
　　 咖啡堿合成酶(TCS)是茶樹咖啡因生物合成途徑中的一個關鍵酶，故抑制TCS基因表達可以有效抑制茶樹中咖啡堿的合成，是培育低咖啡因茶樹的有效途徑。以龍井-43組培苗葉片為材料，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)咖啡堿合成酶保守區(qū)設計簡并引物，采用RT-PCR克隆到一350bp的cDNA序列。根據(jù)序列設計兩對分別加有不同酶切位點的正、反基因的特異上下游引物，擴增出TCS保守區(qū)域的正、反義片斷。

3、將TCS反義片斷、副球菌中類胡蘿卜素合成有關的間隔基因YYT(GenBankwithaccessionnumberAY345165)以及TCS正義片斷串聯(lián)在一起，克隆到T載體。經(jīng)測序鑒定后，雙酶酶切下目標片斷并插入到表達載體PCMBIA1301中，構建TCS基因的RNAi載體。
　　 2.茶樹根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
　　 以茶樹龍井-43組培苗葉片為轉(zhuǎn)化受體，根據(jù)GUS表達情況優(yōu)化了茶樹根癌農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化參數(shù)。結果表

4、明，葉片預培養(yǎng)3d后用濃度OD600為0.8的菌液侵染10min，共培養(yǎng)4天，能夠達到比較好的轉(zhuǎn)化效果，15天后GUS表達率為63.3％。同時對龍井-43組培苗葉片進行了潮霉素敏感實驗，篩選出茶樹葉片農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化中潮霉素的選擇壓濃度為40mg·L-1。
　　 3.野葛愈傷組織提取物清除自由基活性
　　 采用1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH·)的有機自由基體系以及羥自由基和超氧陰離子自由基兩種無機活性氧自由基體系，以野葛

5、根提取物作為對照，對野葛愈傷組織提取物的體外清除自由基和抗氧化活性進行了研究。實驗發(fā)現(xiàn)：野葛愈傷組織提取物對DPPH·清除作用與野葛根提取物相當，而對羥自由基(·OH)的清除作用則弱于野葛根提取物。在濃度為0.2mg·mL-1時，野葛愈傷組織提取物清除O2-·能力較強，顯著優(yōu)于野葛根提取物，而對鄰苯三酚自氧化反應的抑制能力則與野葛根提取物相當。當濃度達到1.0mg·mL-1時，野葛愈傷組織提取物清除O2-·的能力與野葛根提取物相當，而對