人PTH的表達純化及其免疫吸附劑的制備.pdf

1、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是尿毒癥的主要毒性物質(zhì)之一，幾乎所有的腎衰竭患者體內(nèi)含有過高的PTH，過高的PTH使腎衰竭患者處于一種高危狀態(tài)，嚴(yán)重影響腎衰竭患者生存質(zhì)量及生存率。目前針對高PTH的治療方法包括3種:藥物治療、外科手術(shù)和血液凈化。藥物和手術(shù)治療易復(fù)發(fā)，且具有較大副作用。血液凈化方式被認為是一種有效的、很有發(fā)展前景的治療方式。已有的血液凈化療法對PTH的去除能力有限且選擇性低。為了提高吸附劑的

2、選擇性和安全性，本論文利用穩(wěn)定性高，安全性好的特異性IgY為配基，制備了以人PTH為目標(biāo)分子的免疫吸附劑并考察該吸附劑對PTH的吸附能力。本淪文的研究內(nèi)容包括以下幾部分:
　　(1) PTH的原核表達。通過基因工程技術(shù)，分別構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET23a-PTH、pET21b-PTH; PTH在含有pET23a-PTH和pET21b-PTH的E.coli BL21(DE3)中均獲得可溶表達，其中E.coli BL21(DE3)-pET

3、23a-PTH的表達量高，因此選擇pET23a-PTH作為目的蛋白表達的重組質(zhì)粒。通過對菌體的培養(yǎng)條件的優(yōu)化，確定了最終的培養(yǎng)條件為:菌體37℃活化過夜后，1％接菌于50 mL LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)3h后，0.1 mM IPTG誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)4h，目的蛋白表達量約為0.1 mg/mL，達到總蛋白的30％。
　　(2) PTH的純化。菌體經(jīng)冰浴超聲破碎，0.12％(w/v) PEI沉淀，50％飽和度的硫酸銨沉淀，pH3,5檸檬酸緩沖液等電

4、點沉淀， SP強陽離子交換層析得到終產(chǎn)品。終產(chǎn)品經(jīng)SDS-PAGE、SEC-HPLC及RP-HPLC檢測，純度達到95％以上。對終產(chǎn)品進行了鑒定分析，MALDI-TOF-MS測得分子量為9406.777 Da，與理論分子量基本一致，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)其具有良好的免疫原性。
　　(3) PTH免疫吸附劑的制備。將獲得的PTH終產(chǎn)品作為抗原免疫蛋雞，經(jīng)Westernblot和間接ELISA檢測所獲卵黃內(nèi)產(chǎn)生較高效價IgY特異性抗體;Ig

5、Y經(jīng)去除脂質(zhì)，硫酸銨沉淀等步驟初分離后，利用Sepharose-PTH免疫親和柱進行親和純化，純度達92％;將純化得到的抗-PTH IgY固載于羰基二咪唑(N，N'-carbonyldiimidazole，CDI)活化的瓊脂糖凝膠上制各免疫吸附劑，吸附劑對各腎衰竭患者血清樣品中的PTH均有良好去除效果，去除率為40-60％。
　　總之，通過本論文的研究，獲得了對腎衰竭患者血清中PTH具有良好去除效果的免疫吸附劑，為其作為血液凈化裝