重組鼠磷脂酶D2腺病毒的構(gòu)建及其功能的初步研究.pdf

1、目的:構(gòu)建含綠色熒光蛋白(GFP)的鼠磷脂酶D2野生型及其功能缺陷型的重組腺病毒顆粒；初步研究在產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌刺激下細(xì)胞內(nèi)PLD活性變化。 方法:將mPLD2基因及其功能缺陷點(diǎn)突變基因mPLD2(K758R)從真核表達(dá)載體pCGN中分別克隆至帶有GFP的穿梭載體中；再與腺病毒骨架載體一起在E.coliBJ5183中進(jìn)行同源重組，構(gòu)建含GFP的mPLD2及其功能缺陷型的重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒；重組腺病毒質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞

2、中進(jìn)行包裝，產(chǎn)生重組mPLD2(野生型及其功能缺陷型)腺病毒顆粒；用該重組腺病毒感染293細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光產(chǎn)生的情況，同時(shí)免疫印跡確證mPLD2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。　　用重組腺病毒(野生型及其功能缺陷型)分別感染vero細(xì)胞，同時(shí)用空白腺病毒感染vero細(xì)胞作為對照，測定李斯特菌刺激后胞內(nèi)PLD活性變化。 結(jié)果:獲得高滴度重組mPLD2腺病毒顆粒(野生型及其功能缺陷型)，病毒顆粒可有效感染293細(xì)胞，熒光顯微鏡

3、下監(jiān)測到大量發(fā)綠色熒光的細(xì)胞；抗體免疫印跡顯示，mPLD2蛋白在293細(xì)胞中有大量表達(dá)?！　PLD2蛋白、mPLD2(K758R)蛋白的過度表達(dá)對vero細(xì)胞內(nèi)PLD基礎(chǔ)活性無影響；而用李斯特菌刺激后vero細(xì)胞內(nèi)PLD活性較其基礎(chǔ)活性均有明顯的增強(qiáng)(p＜0.001)；在李斯特菌刺激組中，mPLD2蛋白的過度表達(dá)與感染空白腺病毒的對照相比使細(xì)胞內(nèi)PLD活性增強(qiáng)約45％(p＜0.01)，mPLD2(K758R)蛋白的過度表達(dá)使其活性降