農(nóng)桿菌介導(dǎo)反義磷脂酶Dγ基因轉(zhuǎn)化玉米的研究.pdf

1、本研究利用改良的幼穗注射法將反義．PLD<,γ>基因?qū)胗衩鬃越幌掂?8、L9801，在卡那霉素篩選的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了特異PCR擴(kuò)增、PCR-Southem雜交檢測，結(jié)果證明反義PLD<,γ>基因整合到了受體的染色體基因組中；同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系后代變異情況、耐鹽性、耐旱性及主要農(nóng)藝性狀的差異進(jìn)行了研究，并利用生物軟件對(duì)轉(zhuǎn)基因片段進(jìn)行了分析，主要結(jié)果如下： 1．首次獲得了轉(zhuǎn)反義．PZD<,γ>基因的玉米植株?？敲顾睾Y選的抗性苗，經(jīng)特

2、異PCR擴(kuò)增，11個(gè)材料均擴(kuò)增出大約400bp的目的片段與陽性質(zhì)粒擴(kuò)增片段大小相同，PCR-Southern雜交結(jié)果與擴(kuò)增結(jié)果一致，說明該基因整合到玉米的基因組中，獲得了轉(zhuǎn)反義PLD<,γ>基因的玉米植株。 2．T0，T1代中均發(fā)現(xiàn)雄性不育單株。在轉(zhuǎn)化的變異系的不同世代中，均發(fā)現(xiàn)了許多玉米雄性不育株，該植株相對(duì)比較矮小，發(fā)育較慢，其雄花絮發(fā)育較差，小花分布比較稀疏，后期不能散粉，花藥在植株成熟后仍留在穎殼內(nèi)。雄性不育株與對(duì)照在株

3、高、雄花絮長、雄花絮分枝數(shù)、結(jié)實(shí)數(shù)等方面均存在顯著性差異，株高差異尤為顯著，穗位高只是略有變化。 3．T1代轉(zhuǎn)基因玉米自然衰老狀態(tài)下生理指標(biāo)的測定。結(jié)果表明，SOD、POD、可溶性蛋白、CAT在總變化趨勢上，轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照之間沒有顯著性的差異，只是起始變化的日期發(fā)生了改變，轉(zhuǎn)基因植株衰老日期延緩了約6-10天；丙二醛(MDA)和葉綠素變化則比較明顯，MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，它能抑制細(xì)胞保護(hù)酶的活性和降低抗氧化物的含量，從

4、而加劇膜脂過氧化作用，它反映植物受傷害程度。分析表明轉(zhuǎn)基因植株MDA含量總是低于對(duì)照，并且轉(zhuǎn)基因植株葉綠素保持了較高的含量?？梢娹D(zhuǎn)反義PLD<,γ>基因主要通過抑制膜脂的過氧化作用，從而延緩了植株的衰老。 4．轉(zhuǎn)基因玉米株高發(fā)生了廣泛的變異。夏播T0代株高明顯矮于對(duì)照，差異達(dá)到極顯著水平。對(duì)溫室株高做聚類分析，可以看出T0代鄭58株高，發(fā)生了不連續(xù)的分離，除去幾個(gè)特殊植株外，如高株177cm、168cm，矮株34cm，在5.60

5、距離處分開，可以將整個(gè)群體劃分為四個(gè)大類群；T0代L980l株高分離的類型較鄭58更加豐富，在7.40距離處分開，可以將所得株高劃分為6個(gè)類群。T1代是T0代溫室收獲的單穗種成的株行，各株行內(nèi)個(gè)體間基本均勻一致，顯著性分析表明，株高和穗位高表現(xiàn)為極顯著差異，而同為T1代，株高及其它農(nóng)藝性狀也有差異，分析結(jié)果和T0代株高分析相似。T2代株高保持了T1代株高的變異，基本處于穩(wěn)定。 5．轉(zhuǎn)基因株系質(zhì)膜透性的分析。T0代鄭58植株電導(dǎo)率

6、值在1.787-3.611之間呈現(xiàn)不連續(xù)的變動(dòng)。如果從最短距離0.12處分開，可以將數(shù)據(jù)分為11類，除比較集中的兩類外，其它類為單株或少量幾株；T0代L9801電導(dǎo)率變動(dòng)范圍在1.143～2.272之間，在最短距離0.09下劃分為5類，0.12距離下劃分為4類，類和類之間差異顯著。對(duì)T1代植株取相同部位葉片，用1％NaCL處理2天、4天、6天，然后測電導(dǎo)率，隨處理天數(shù)的增加，電導(dǎo)率是增加的，但轉(zhuǎn)基因株系均略低于其相應(yīng)的對(duì)照。說明PLD<

7、,γ>反義基因具有提高轉(zhuǎn)化材料的耐鹽性或耐旱性的效應(yīng)。 6．轉(zhuǎn)基因株系農(nóng)藝性狀變異廣泛。轉(zhuǎn)基因株系在農(nóng)藝性狀上與受體存在顯著差異，主要表現(xiàn)為株高、生育期、雄花絮的變異上，Z4.6轉(zhuǎn)基因株系的成熟期明顯比受體提早6～10d，這對(duì)改善受體成熟偏晚的缺點(diǎn)極為有利。轉(zhuǎn)基因玉米還存在其它的變異，涉及到植株和籽粒的各種特征，類型相當(dāng)豐富，包括莖桿顏色、籽粒顏色、籽粒大小和使用除草劑后表現(xiàn)出來的部分耐受性。 7．轉(zhuǎn)基因片段的生物軟件分