煙曲霉磷脂酶D基因敲除及其功能研究.pdf

1、目的:煙曲霉是一種重要的機會致病真菌,它能引起免疫缺陷患者嚴重的感染。磷脂酶D是病原微生物的一種重要的致病因子。磷脂酶D在煙曲霉中的作用還沒有研究和報道。本課題研究磷脂酶D在煙曲霉致病機制中的作用,為進一步探討煙曲霉的致病機制以及煙曲霉感染的預防和治療提供新的思路和方法。
　　 方法:本研究采用根癌農桿菌介導轉化(ATMT)的方法,根據同源重組的原理,用潮霉素抗性基替代煙曲霉磷脂酶D基因,構建煙曲霉磷脂酶D敲除株。通過人肺細胞模

2、型(A549細胞)體外檢測煙曲霉磷脂酶D敲除株的粘附能力和侵染能力;通過免疫缺陷小鼠模型(非中性粒細胞減少免疫缺陷小鼠模型和中性粒細胞減少免疫缺陷小鼠模型)檢測敲除株在體內毒力的變化。
　　 結果:SouthernBlot驗證成功得到煙曲霉磷脂酶D的敲除株和回補株。煙曲霉磷脂酶D敲除后,其胞內和胞外磷脂酶D的活性都明顯下降。磷脂酶D敲除株菌落大體形態(tài),生長速率,萌發(fā)率,菌絲干重及其生物膜形成都無明顯的變化。磷脂酶D敲除株對A54

3、9的粘附能力無明顯變化,但是對A549細胞的侵染能力顯著下降。磷脂酶D敲除株回補磷脂酸(磷脂酶D水解磷脂產生的重要產物)的濃度達到20μM時,其侵染能力恢復到野生株的水平;當磷脂酸回補在100μM的時候,野生株和敲除株的侵染能力無差別。同時,J774細胞(小鼠巨噬細胞)對磷脂酶D敲除株的吞噬能力無變化。磷脂酶D的廣譜抑制劑1-丁醇和哺乳動物磷脂酶D1的特異性抑制劑處理孢子后,孢子對A549細胞的侵染能力顯著下降,J774細胞對磷脂酶D敲