自噬在尿蛋白所致近端腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、目的:
　　探討自噬在尿蛋白所致近端腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用，為尿蛋白所致慢性腎臟疾病尋找新的治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.硫酸銨沉淀法提取輕微病變型腎病綜合征患者尿液中的尿蛋白，蛋白電泳分析其成分。
　　2.用不同濃度（0、0.1、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml）的尿蛋白按不同時(shí)間(0、2、4、8、12、24、36、48h)處理體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)自

2、噬體標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein1 light chain3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)的表達(dá)。
　　3.雷帕霉素（10μM）、氯喹（10μM）、尿蛋白(8mg/ml)分組處理HK-2細(xì)胞8h，免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)自噬體標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ和溶酶體膜標(biāo)記蛋白(lysosomal-associated membrane protein2,LAMP2)的表達(dá)。
　　4.雷帕

3、霉素(10μM)、氯喹(10μM)、尿蛋白(8mg/ml)分組處理HK-2細(xì)胞24-36h，TUNEL檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，MTT檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)活力，ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清Kim-1和NGAL水平。
　　結(jié)果:
　　1.所提取尿蛋白的成份
　　輕微病變型腎病綜合征患者來源的尿蛋白其主要成分為白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和IgGs等，分別占88.0％、8.5％、3.3％，其它占0.2％。
　　2.尿蛋白對(duì)HK-2細(xì)胞內(nèi)LC

4、3-Ⅱ表達(dá)的影響
　　免疫熒光顯示:LC3-Ⅱ陽性點(diǎn)隨著尿蛋白刺激濃度升高而增多;免疫印跡進(jìn)一步證實(shí):LC3-Ⅱ的表達(dá)隨著尿蛋白刺激濃度升高而增多，8mg/ml時(shí)達(dá)到高峰，8mg/ml尿蛋白組LC3-Ⅱ的灰度值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);同時(shí)，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3-Ⅱ的表達(dá)逐漸增多，8h達(dá)到高峰，8h組LC3-Ⅱ的灰度值明顯高于0h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.尿蛋白對(duì)HK-2細(xì)

5、胞自噬流量的影響
　　熒光雙標(biāo)記發(fā)現(xiàn):①與對(duì)照組相比，尿蛋白組LC3-Ⅱ陽性點(diǎn)（綠色熒光）增多，而且LAMP2陽性點(diǎn)（紅色熒光）由散在分布于胞漿變得向核周聚集;②與對(duì)照組相比，雷帕霉素組和氯喹組LC3-Ⅱ陽性點(diǎn)均增多，而氯喹組LAMP2陽性點(diǎn)增多較雷帕霉素組更為明顯;③與對(duì)照組相比，雷帕霉素、氯喹與尿蛋白共處理組LC3-Ⅱ陽性點(diǎn)均增多，而氯喹組LAMP2陽性點(diǎn)顯著增多，且LC3-Ⅱ和LAMP2共定位（黃色熒光）的自噬溶酶體增多。<

6、br>　　免疫印跡進(jìn)一步證實(shí):①與尿蛋白組相比，雷帕霉素組LC3-Ⅱ的表達(dá)顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而LAMP2的變化不明顯，②與尿蛋白組相比，氯喹組LC3-Ⅱ的表達(dá)顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)，LAMP2亦顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.調(diào)節(jié)自噬流量對(duì)尿蛋白所致HK-2細(xì)胞損傷的影響
　　結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，尿蛋白處理組凋亡率顯著增加(P＜0.05);上清中急