自噬對碘對比劑致人腎小管上皮細(xì)胞毒性的作用.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)以碘海醇(200mg(Ⅰ)/ml)干預(yù)體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)建立細(xì)胞損傷模型，觀察碘對比劑(iodinated contrastmedia，CM)致人腎小管上皮細(xì)胞損傷中的自噬現(xiàn)象，并初步探討自噬在CM致人腎小管上皮細(xì)胞損傷和凋亡中的作用。
　　方法:
　　1.碘海醇(200mg(Ⅰ)/ml)分別干預(yù)HK-2細(xì)胞3h，6h，建立細(xì)胞損傷模型。Westen Blot檢測自噬標(biāo)志蛋白微

2、管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3Ⅱ)、自噬相關(guān)蛋白Atg7的表達(dá)變化。干預(yù)6h后，LC3Ⅱ-FITC熒光共聚焦顯微鏡觀察LC3Ⅱ標(biāo)記的自噬體形成，透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體形成。
　　2.碘海醇(200mg(Ⅰ)/ml)干預(yù)HK-2細(xì)胞6h建立細(xì)胞損傷模型，應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）10mmol/l共處理細(xì)胞抑制自噬。同上采用Westen Blot檢測LC3Ⅱ、Atg7表達(dá);細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶

3、(LDH)檢測細(xì)胞損傷程度;AnnexinⅤ-FITC結(jié)合流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測細(xì)胞凋亡比例。
　　結(jié)果:
　　1.碘海醇(200mg(Ⅰ)/ml)干預(yù)6h后，透射電鏡可觀察到HK-2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬體的增多，共聚焦顯微鏡下觀察到LC3Ⅱ標(biāo)記的自噬體的形成。與正常對照組相比，碘海醇干預(yù)組HK-2細(xì)胞3h、6h自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Atg7表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，并呈時(shí)間依賴性。
　　2.3-MA可明顯抑制HK-2細(xì)胞自噬，

4、單純3-MA干預(yù)組與正常對照組相比，以及碘海醇+3-MA干預(yù)組與單純碘海醇干預(yù)組相比，自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ以及Atg7表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.05，P＜0.05)。同時(shí)，與單純碘海醇干預(yù)組相比，加用用3-MA抑制自噬后，細(xì)胞上清液LDH明顯升高(P＜0.05)，HK-2細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.碘對比劑（碘海醇，200mg(Ⅰ)/ml）呈時(shí)間依賴性誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生自噬。
　　2.自噬