大鼠膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子克隆及表達的研究.pdf

1、膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(glial cellline-derived neurotrophic factor GDNF)是1993年被發(fā)現(xiàn)的對多巴胺能神經元有特異性營養(yǎng)作用的一種神經營養(yǎng)因子，結構顯示它是TGF-β超家族中的一個新的成員。自GDNF被發(fā)現(xiàn)以后，眾多學者對其結構、分布、功能與作用進行了大量的研究，并取得了相當有意義的成果，同時GDNF在治療神經系統(tǒng)疾病方面被廣泛研究，包括對帕金森氏病(PD)、脊髓側索硬化癥(ALS)及其

2、他神經變性疾病等領域的研究，其中PD的病理基礎已經明確，是由于選擇性多巴胺能神經元喪失導致多巴胺缺乏所致，目前認為，基因治療可能是實現(xiàn)治療PD這一目標的最佳途徑，而對PD等疾病的治療手段包括藥物治療和各種外科手術、腦組織移植等均只限于暫時的癥狀改善，不能從根本上延緩或阻止其病程進展，理想的治療方法除了要糾正其腦內DA含量的不足，還要保護殘存的DA能神經元。迄今為止，國內外的基因治療研究探索主要集中于兩個方向，一是通過給予各種神經營養(yǎng)因子

3、或抗凋亡分子基因，研究其對DA能神經元的保護作用；二是通過給予酪氨酸羥化酶(TH)基因，提高DA的合成。國內外研究表明了GDNF是最強有力的保護因子，GDNF基因的有效表達可以減緩、阻止甚至逆轉DA能神經元的退行性病變過程，為此我們克隆了大鼠GDNF全長基因，主要采用分子克隆、細胞培養(yǎng)和動物肌肉表達等研究方法，將GDNF基因分別構建入原核表達載體pET32a和真核表達載體pEGFP-Cl，通過IPTG誘導法和離體細胞轉染法研究證實其具有

4、明確的轉基因生物活性后，再將真核重組表達質粒pEGFP-GDNF注射到小鼠后肢股四頭肌內，初步了解其體內表達情況，以此尋找基因治療的最佳途徑。 主要研究方法和結果如下： 1．從2日內大乳鼠腦組織中提取總RNA，參照分子克隆指南稍作修改，合成cDNA第1、2鏈，加入引物通過PCR擴增目的基因，得到636bp的目的片段后，克隆到pMD18-T載體中，得到重組pMD18-T-GDNF。 2．將GDNF克隆到pGEM-T

5、載體中，得到重組pGEM-T-GDNF；將重組質粒pGEM-T-GDNF、pET32a原核表達載體及pEGFP-C1真核表達載體進行BamHI、XhoI雙酶切，構建重組表達質粒，然后對重組表達質粒進行酶切鑒定、PCR鑒定并測序驗證。 3．將鑒定正確的原核重組表達質粒轉入BL21(DE3)中進行表達，并采用SDS-PAGE、Western-blot等方法對表達產物進行鑒定。 4．以陽離子聚合物法將真核重組表達質粒轉染入中國

6、倉鼠卵巢細胞(CHO)中表達，通過RT-PCR、免疫細胞化學技術及熒光顯微鏡觀察來確定轉染效率。 5．將pEGFP-GDNF注射入BABL/c小鼠后肢肌肉內，通過熒光顯微鏡和免疫組織化學方法觀察體內表達情況。 結果：①GDNF基因的克隆 從新生大鼠腦組織中成功提取總RNA反轉錄cDNA后，PCR擴增的GDNF目的基因為636bp，與克隆載體連接構建克隆重組質粒，經酶切鑒定得到一條與目的基因大小一致的條帶和一條載體

7、帶，測序后發(fā)現(xiàn)，目的基因序列與Genebank上發(fā)表的GDNF基因序列完全一致。 ②GDNF基因的原核表達 為了獲得GDNF基因的表達產物，成功將克隆質粒亞克隆至原核表達載體pET32a中，重組原核表達質粒經IPTG誘導后在蛋白電泳圖譜可以看到明顯的目的蛋白條帶，Western-blot的特異條帶也驗證了這一點。 ③GDNF基因的真核表達 成功將克隆質粒亞克隆至pEGFP-C1真核表達載體中，將真核重組表

8、達質粒轉染CHO細胞后，經RT-PCR鑒定和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞液經擴增得到目的條帶，在熒光顯微鏡下經藍光激發(fā)，可以觀察到CHO細胞胞漿內呈現(xiàn)綠色熒光，將小鼠后肢肌肉的石蠟切片進行胰蛋白酶抗原修復后，在熒光顯微鏡下觀察到散在的綠色熒光，免疫組化染色可以看到肌纖維細胞周圍有黃色的斑點，以上結果提示EGFP基因及GDNF基因的進一步表達，說明目的基因片段已成功表達。 結論：①本研究利用分子生物學技術，成功的克隆了大鼠GDNF基因

9、，測序結果證明與Gelaebank發(fā)表的序列完全一致。 ②將克隆至pGE-T載體中的GDNF基因亞克隆至原核表達載體pET32a中，并在E.coliBL21(DE3)中進行表達。經SDS-PAGE和Western-blot分析，表明目的基因獲得了表達。 ③將重組質粒pGEM-TGDNF中的GDNF基因亞克隆至pEGFP-C1真核表達載體中，成均的構建出真核重組表達質粒pEGFP-GDNF，以陽離子聚合物介導法將真核重組表

10、達質粒pEGFP-GDNF轉染至CHO細胞中，通過RT-PCR檢測法、熒光檢測和免疫細胞化學檢測法證實GDNF基因在哺乳動物細胞中獲得了表達。再將真核重組表達質粒pEGFP-GDNF注入BALB/c小鼠后肢肌肉中，同時設pEGFP-C1對照組，通過熒光檢測法和免疫組織化學檢測法證實了GDNF基因在小鼠肌肉中獲得了表達。原核和真核重組表達質粒的成功構建，為進一步獲得重組活性的GDNF蛋白和神經系統(tǒng)疾病的基礎和臨床的基因治療研究奠定了基礎。