趨化因子SDF-1及其受體CXCR4在結(jié)腸癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的： 1.研究人類結(jié)腸癌中SDF-1、CXCR4、VEGF-C、VEGFR-3、Podoplanin的表達(dá)特點(diǎn)，以及它們與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探索SDF-1、CXCR4、VEGF-C、VEGFR-3、Podoplanin在結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的意義。 2.研究趨化因子受體CXCR4反義核酸轉(zhuǎn)染導(dǎo)入HT-29和HCT-116細(xì)胞系后對(duì)其VEGF-CmRNA和VEGF-C蛋白功能性表達(dá)的影響，觀察CXCR4反義核酸對(duì)結(jié)腸

2、癌HT-29和HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和體外侵襲能力的抑制效應(yīng)。 3.研究CXCR4RNA干擾對(duì)HT-29和HCT-116細(xì)胞中VEGF-CmRNA和VEGF-C蛋白表達(dá)的抑制作用，評(píng)價(jià)其對(duì)HT-29和HCT-116細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響。 方法： 1.采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)SDF-1、CXCR4、VEGF-C、VEGFR-3和Podoplanin在70例結(jié)腸癌標(biāo)本和12例癌旁正常結(jié)腸標(biāo)本中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)

3、分析它們與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。 2.構(gòu)建CXCR4反義核酸的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，通過(guò)脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT-29和HCT-116細(xì)胞系，采用RT-PCR檢測(cè)以上2種細(xì)胞VEGF-CmRNA的表達(dá)，采用Westernblot檢測(cè)以上2種細(xì)胞VEGF-C蛋白的表達(dá)，同時(shí)，采用MTT法了解以上2種細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，采用Boyden小室檢測(cè)這2種細(xì)胞的體外侵襲能力。 3.構(gòu)建靶向CXCR4基因的小干擾RNA

4、(siRNA)，用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)入HT-29和HCT-116細(xì)胞中，設(shè)立轉(zhuǎn)染空載體的同樣細(xì)胞作為陰性對(duì)照，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照。采用RT-PCR和Westernblot檢測(cè)以上3組細(xì)胞VEGF-CmRNA和VEGF-C蛋白的表達(dá)，采用MTT法了解以上3組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，采用Boyden小室檢測(cè)這3組細(xì)胞的體外侵襲能力。通過(guò)熒光顯微鏡觀察標(biāo)記有綠色熒光蛋白的CXCR4.基因的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.60.0％的結(jié)腸癌中存在

5、CXCR4蛋白的表達(dá)，71.4％的結(jié)腸癌中存在SDF-1蛋白的表達(dá)，64.3％的結(jié)腸癌中存在VEGF-C蛋白的表達(dá)，48.6％的結(jié)腸癌中存在VEGFR-3蛋白的表達(dá)，54.3％的結(jié)腸癌中存在Podoplanin蛋白的表達(dá)，它們?cè)诹馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)同非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)相比，均有顯著性差異(88.6％vs.42.3％，75.0％vs.31.0％，79.5％vs.38.5％，63.4％vs.23.1％，72.7vs.23.1％)，(P＜

6、0.01或P＜0.05)。 2.SDF-1，CXCR4，VEGF-C，VEGFR-3和Podoplanin的表達(dá)與侵襲深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.01或P＜0.05)，SDF-1的表達(dá)還與TNM分期相關(guān)(P＜0.05)。然而，它們的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均不相關(guān)(p＞0.05)。 3.在SDF-1與VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)之間(r=0.608，P＜0.05)、CXCR4與VEGF-C的

7、陽(yáng)性表達(dá)之間(r=0.750，P＜0.05)、VEGF-C與VEGFR-3的陽(yáng)性表達(dá)之間p=0.312，P＜0.01)以及Podoplanin與VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)之間(r=0.425，P＜0.01)均存在著顯著的正相關(guān)(P＜0.01或P＜0.05)。 4.成功構(gòu)建了CXCR4反義核酸的重組質(zhì)粒，用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)入HT-29和HCT-116細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，對(duì)HT-29的VEGF-CmRNA表達(dá)抑制率可達(dá)64.8％，對(duì)

8、HT-29的VEGF-C蛋白表達(dá)抑制率可達(dá)59.1％；對(duì)HCT-116的VEGF-CmRNA表達(dá)抑制率可達(dá)57.2％，對(duì)HCT-116的VEGF-C蛋白表達(dá)抑制率可達(dá)52.0％；表明結(jié)腸癌細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4的表達(dá)與VEGF-CmRNA的表達(dá)存在著明顯的相關(guān)性，通過(guò)CXCR4反義核酸技術(shù)可以在核酸水平上較大程度地阻斷結(jié)腸癌HT-29及HCT-116細(xì)胞的VEGF-CmRNA及蛋白表達(dá)。 5.結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGenesil

9、-CXCR4之后，HT-29細(xì)胞VEGF-CmRNA和蛋白表達(dá)的抑制率可分別達(dá)86.6％和79.2％，與對(duì)照組相比差異非常顯著(P＜0.01)；HCT-116細(xì)胞VEGF-CmRNA和蛋白表達(dá)的抑制率可分別達(dá)77.4％和71.9％，與對(duì)照組相比差異非常顯著(P＜0.01)。CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染后HT-29和HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比空載體組和未轉(zhuǎn)染組顯著降低。HT-29細(xì)胞CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組的平均穿膜細(xì)胞數(shù)為34.6±5

10、.3％，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組平均穿膜細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)為93.9±6.4％，陰性對(duì)照組平均穿膜細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)為95.2±5.8％，轉(zhuǎn)染組與另兩組相比有顯著性差異(P＜0.01)，而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)；HCT-116細(xì)胞CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組的平均穿膜細(xì)胞數(shù)為38.8±4.9％，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組平均穿膜細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)為97.2±6.5％，陰性對(duì)照組平均穿膜細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)為97.8±7.4％，轉(zhuǎn)染組與另兩組相比有顯著性差異(

11、P＜0.01)，而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。HT-29和HCT-116細(xì)胞中標(biāo)記綠色熒光蛋白的CXCR4基因表達(dá)在RNA干擾之后顯著減少。 結(jié)論： 1.SDF-1、CXCR4、VEGF-C、VEGFR-3和Podoplanin的異常表達(dá)在結(jié)腸癌淋巴道轉(zhuǎn)移中具有重要作用，聯(lián)合檢測(cè)SDF-1、CXCR4、VEGF-C、VEGFR-3和Podoplanin的表達(dá)可能對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者的臨床分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)

12、后有幫助。 2.結(jié)腸癌細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4的表達(dá)與VEGF-CmRNA及蛋白的表達(dá)存在著明顯的相關(guān)性，通過(guò)CXCR4反義核酸技術(shù)可以在核酸水平上較大程度地阻斷結(jié)腸癌HT-29及HCT-116細(xì)胞的VEGF-CmRNA表達(dá)，從而對(duì)結(jié)腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移等惡性表型進(jìn)行一定程度的逆轉(zhuǎn)。 3.構(gòu)建的CXCR4siRNA對(duì)結(jié)腸癌HT-29和HCT-116細(xì)胞VEGF-C基因mRNA和蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示這種