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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分CXCR4在卵巢癌的表達(dá)及與臨床的關(guān)系
目的:檢測(cè)CXCR4在卵巢癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá),探討其與臨床病理特征之間的關(guān)系及與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性。
方法:
1.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CXCR4、β-catenin在7例正常卵巢上皮組織及49例卵巢癌組織中的表達(dá),分析CXCR4與臨床病理特征之間的關(guān)系,Pearson’s 法分析CXCR4與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性。
2、 2.通過(guò)Real-Time PCR方法檢測(cè)CXCR4在正常卵巢上皮組織、卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞株中的mRNA的表達(dá)。
3.通過(guò)Western blot 方法檢測(cè)CXCR4在正常卵巢上皮組織及卵巢癌細(xì)胞株中的蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:
1.CXCR4與β-catenin在卵巢癌組織中均具有異常表達(dá),兩者之間具有顯著的相關(guān)性。CXCR4的表達(dá)與卵巢癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
2.CX
3、CR4 mRNA在卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞株CAOV3、SKOV3和A2780中均具有高表達(dá),其表達(dá)量分別為正常卵巢上皮組織中CXCR4 mRNA表達(dá)量的(6.1 0±2.4)倍、(6.01±0.3)倍、(4.33±0.3)倍和(3.62±0.6)倍,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.卵巢癌細(xì)胞株CAOV3、SKOV3和A2780中CXCR4 蛋白表達(dá)比正常卵巢上皮組織高(3.51±0.08)、(2.95±0.14)、(2.82±
4、0.10)倍,差異顯著。
結(jié)論:CXCR4在卵巢癌組織及細(xì)胞株中均有高表達(dá),與β-catenin表達(dá)顯著相關(guān),且與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
第二部分CXCR4 shRNA 對(duì)卵巢癌細(xì)胞CAOV3 侵襲轉(zhuǎn)移影響的實(shí)驗(yàn)研究
目的:利用RNAi 技術(shù)沉默CXCR4基因在CAOV3細(xì)胞株中的表達(dá),觀察干擾后CAOV3細(xì)胞增殖和侵襲能力的變化。
方法:
1.通過(guò)RNAi 技術(shù)
5、構(gòu)建4 條CXCR4 shRNA表達(dá)載體,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至CAOV3細(xì)胞,用Real-Time PCR法及Western blot 法檢測(cè)shRNA 對(duì)CXCR4的抑制效率。
2.通過(guò)MTT 方法觀察CXCR4基因沉默后CAOV3細(xì)胞增殖的變化。
3.應(yīng)用Transwell 侵襲小室方法觀察CXCR4基因沉默對(duì)CAOV3細(xì)胞侵襲能力的影響。
結(jié)果:
1.成功構(gòu)建4 條CXCR4 sh
6、RNA表達(dá)載體,Real-Time PCR結(jié)果表明,與shNC組相比,轉(zhuǎn)染CXCR4 shRNA-151、shRNA-701和shRNA-868組CXCR4的mRNA表達(dá)分別下降了88%(P=0.005)、69%(P=0.019)和91%(P=0.003),其中shRNA-868抑制效率最為明顯。同時(shí),Western blot 結(jié)果證明shRNA-868 對(duì)CXCR4 蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用。
2.MTT 方法結(jié)果表明
7、CXCR4 shRNA 對(duì)CAOV3細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。
3.Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)證明CXCR4基因沉默后CAOV3細(xì)胞的體外侵襲能力明顯降低。
結(jié)論:CXCR4基因沉默能夠抑制卵巢癌細(xì)胞株CAOV3的增殖和侵襲能力,CXCR4在卵巢癌轉(zhuǎn)移中起重要作用。
第三部分:干擾卵巢癌CXCR4基因調(diào)控Wnt/β-catenin 通路的實(shí)驗(yàn)研究
目的:觀察CXCR4基因沉默后
8、Wnt/catenin 通路相關(guān)基因表達(dá)的變化,探討CXCR4在卵巢癌轉(zhuǎn)移中作用機(jī)制。
方法:
1.Real-Time PCR法檢測(cè)CXCR4 shRNA 對(duì)Wnt/catenin 通路關(guān)鍵基因CTNNB1(編碼catenin)、主要靶基因C-MYC、MMP-9和CD44 及EMT 相關(guān)基因Vimentin和SLUG的mRNA表達(dá)的影響。
2.Western blot 法觀察特異性CXCR4 s
9、hRNA 對(duì)侵襲相關(guān)基因MMP-9和Vimentin 蛋白表達(dá)的影響。
結(jié)果:
1.Real-Time PCR結(jié)果表明CXCR4基因沉默后CTNNB1、MMP-9、CD44、C-MYC、SLUG和Vimentin的mRNA表達(dá)分別下降了90.5%、26.1%、35.4%、93.5%、91.5%和78.3%。
2.Western blot 結(jié)果顯示特異性CXCR4 shRNA 能夠顯著抑制Wnt
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