三維記憶應(yīng)力場下長骨干骨折愈合的生物學(xué)特征與相關(guān)成骨信號機制的研究.pdf

1、目的：明確SMC產(chǎn)生的特殊三維記憶應(yīng)力環(huán)境下長骨干骨折愈合的生物學(xué)特征，并探索這種特殊應(yīng)力通過何種途徑啟動了骨折愈合所需的一系列生物學(xué)效應(yīng)。方法：建立新西蘭兔肱骨干骨折內(nèi)固定模型，分別用SMC和DCP固定，部分SMC固定的動物以Celecoxib抑制COX-2活性。術(shù)后通過實時定量PCR技術(shù)檢測標本中COX-1和COX-2基因mRNA在不同時期的表達量；通過放射免疫測定法檢測了骨折局部PGE2和cAMP的含量變化；通過紫外分光光度計方法

2、測定骨痂礦物質(zhì)代謝指標；通過組織形態(tài)學(xué)方法對各組的骨折愈合過程進行了動態(tài)觀察；并用RT-PCR反應(yīng)測定了若干細胞外基質(zhì)蛋白基因的表達趨勢。結(jié)果：術(shù)后3-4周時SMC固定的動物骨折間隙處骨痂標本的COX-2mRNA的相對表達量和PGE2、cAMP含量明顯高于DCP固定者。相應(yīng)的，此時SMC固定者骨折間隙處骨痂標本中鈣磷含量、Ⅰ型膠原和骨鈣素基因表達量以及血清中骨特異性堿性磷酸酶活性也均明顯升高；軟骨內(nèi)成骨和編織骨骨痂的形成較早。抑制SMC

3、應(yīng)力環(huán)境下COX-2的活性及PGE2和cAMP的合成之后，礦物質(zhì)代謝、軟骨內(nèi)骨化和細胞外基質(zhì)蛋白基因的表達也均受到抑制。結(jié)論：SMC的特殊三維記憶應(yīng)力環(huán)境可以促進骨痂細胞外基質(zhì)的礦化和軟骨內(nèi)成骨，從而加速骨折愈合，而且該效應(yīng)與COX-2、PGE2、cAMP這一 基于鎳鈦形狀記憶合金的物理特性和上肢長骨干的解剖特點，我們研制了可用于上肢骨折內(nèi)固定的形狀記憶接骨器(shapememorycompressiveconnector,SM

4、C)。SMC在固定長骨干骨折時可以產(chǎn)生特殊的三維記憶應(yīng)力場，既保證了穩(wěn)定又在骨折端產(chǎn)生持續(xù)動態(tài)的壓應(yīng)力，其力值大小接近生理范圍、方向也符合骨干軸向，并持續(xù)存在至愈合后期骨痂塑形及被板層骨替代時，臨床應(yīng)用療效良好。為了明確這種應(yīng)力環(huán)境下長骨干骨折愈合的生物學(xué)特征，并探索這種特殊應(yīng)力通過什么途徑啟動了骨折愈合所需的一系列生物學(xué)效應(yīng)，我們進行了本課題研究。 我們建立了新西蘭兔肱骨干骨折內(nèi)固定模型。A組：肱骨干截骨處以SMC內(nèi)固定；B組

5、：肱骨干截骨處以4孔動力加壓接骨板(dynamiccompressionplate，DCP)內(nèi)固定；C組：肱骨干截骨處以SMC內(nèi)固定，且自術(shù)后第一天起經(jīng)口給予塞來昔布(Celecoxib)懸液，劑量為3.5mg/kg/d。術(shù)后分別通過RT-PCR反應(yīng)測定了若干骨折愈合相關(guān)基因的表達趨勢；通過放射免疫測定法檢測了骨折局部PGE2和cAMP的含量變化；通過紫外分光光度計的方法測定了骨痂的鈣、磷含量和血清中骨特異性堿性磷酸酶(bone-spe

6、cificalkalincphosphatase，B-ALP)的活性；并用組織形態(tài)學(xué)方法對各組的骨折愈合過程進行了動態(tài)觀察。 三組動物均于術(shù)后3、7、14、21、28、56、84天時處死取材，切取骨折斷端間的連接骨痂留作標本。通過實時定量PCR技術(shù)檢測標本中COX-1和COX-2基因mRNA在不同時期的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三組術(shù)后COX-2mRNA的相對表達量均較術(shù)前顯著上升，且術(shù)后3-4周時A組和C組明顯高于B組。而COX-1m

7、RNA的相對表達量在各時間點及各組之間未體現(xiàn)出明顯差異。術(shù)后7、14、21、28、56天時在骨折間隙取骨痂，應(yīng)用放射免疫方法檢測骨折局部PGE2和cAMP的含量。骨折后3周及4周時SMC內(nèi)固定的A組的PGE2和cAMP的含量明顯高于DCP固定的B組和以Celecoxib抑制的C組，B、C兩組間無明顯差異。上述結(jié)果提示，SMC在穩(wěn)定骨折端的基礎(chǔ)上在骨折間隙處產(chǎn)生持續(xù)動態(tài)壓應(yīng)力，這種特殊的三維記憶應(yīng)力場可以通過誘導(dǎo)COX-2的表達引起PGE

8、2合成量的增高，這些PGE2作用于特定的受體引起細胞內(nèi)cAMP水平升高，然后經(jīng)PKA途徑導(dǎo)致一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，最終使得成骨細胞分化成熟并提高了細胞的成骨功能活性，這促進了骨折的愈合。 術(shù)后分期取材，以比色法測定骨折間隙中鈣、磷元素的含量和血清中B-ALP的活性。骨折間隙內(nèi)骨痂鈣、磷元素的含量均逐漸升高；血中骨特異性堿性磷酸酶的活性大致在術(shù)后4至8周時升至峰值，隨后緩慢下降。術(shù)后3-4周時SMC內(nèi)固定的A組骨折間隙內(nèi)骨痂的

9、鈣、磷含量和血中B-ALP活性均明顯高于DCP固定的B組和以Celecoxib抑制的C組，而且A組動物的血漿B-ALP活性高峰早于B、C兩組。組織學(xué)觀察顯示：三組動物骨折間隙內(nèi)均經(jīng)歷了軟骨內(nèi)骨化的愈合過程。骨折后1周時，骨折斷端為機化的血腫和肉芽組織，各組細胞成分相似。術(shù)后2-4周期間A組骨折間隙內(nèi)軟骨內(nèi)成骨的出現(xiàn)和編織骨骨痂的形成早于B組和C組，隨后A組也較早出現(xiàn)了板層骨替代。而且在編織骨痂形成及板狀骨替代的過程中，A組的骨痂組織學(xué)結(jié)

10、構(gòu)也較同時期的B、C兩組成熟。骨折后3、7、14、21、28、56天的標本進行半定量RT-PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示A組Ⅱ型膠原mRNA的表達較B、C兩組提前結(jié)束，而A組Ⅰ型膠原和骨鈣素mRNA的表達量在骨折后3-4周期間明顯高于B、C兩組，而且Ⅰ型膠原mRNA的表達高峰和骨鈣素mRNA的上升也明顯較早。這些結(jié)果提示：SMC特殊的三維記憶應(yīng)力場通過COX-2、PGE2、cAMP及PKA這一信號通路調(diào)節(jié)了骨折處的礦物質(zhì)代謝，促進了鈣、磷元素在細