體外三維培養(yǎng)成肌干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究.pdf

1、骨骼肌組織工程的醫(yī)學(xué)介入,在改善移植細(xì)胞的質(zhì)量和生存方面擁有巨大潛力。目前在骨骼肌三維培養(yǎng)、體外大塊組織構(gòu)建等方面面臨巨大的挑戰(zhàn),使各種因?yàn)樵斐傻氖Ч趋兰〗M織功能的重建缺乏功能性組織代用品而受阻。運(yùn)用組織工程替代品體內(nèi)修復(fù)缺失的肌肉功能是有困難的:1、再建肌肉組織需要具有天然組織結(jié)構(gòu)和充分的再生能力；2、組織結(jié)構(gòu)進(jìn)入宿主后缺乏活力和相容性。許多學(xué)者在骨骼肌的體外構(gòu)建和替代研究方面做了大量研究,試圖創(chuàng)建功能化的肌組織:Dennis和Kos

2、nik等[1,2]探索出三維骨骼肌組織的自組裝模式,將成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)并包裹形成肌管,橫向電刺激時產(chǎn)生持續(xù)的興奮和收縮；德國的Bach[3,4]鍆研究組進(jìn)行了成肌細(xì)胞與纖維蛋白三維支架的復(fù)合培養(yǎng),獲得具有極性分化功能的多核肌管；Sxena采用聚乙醇酸網(wǎng)與成肌細(xì)胞復(fù)合并進(jìn)行體內(nèi)移植,獲得血管化的骨骼肌樣組織。盡管國外學(xué)者已涉及骨骼肌組織工程三維構(gòu)建研究,但都處于初級摸索階段,國內(nèi)目前尚沒有體外骨骼肌三

3、維構(gòu)建的文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于國內(nèi)外現(xiàn)狀,我們實(shí)驗(yàn)組在體外三維骨骼肌的構(gòu)建方面進(jìn)行初步的探索。眾所周知,骨骼肌組織工程包括三要素,即干細(xì)胞、支架、生長因子。細(xì)胞與支架材料的相互作用是組織工程研究的主要領(lǐng)域,其目的是使細(xì)胞能在基質(zhì)材料上貼附和正常生長。體外條件下,能否獲取極性、平行排列的分化肌管,是三維肌組織構(gòu)建成功的關(guān)鍵,因?yàn)榧±w維的平行排列特性,是肌組織發(fā)揮收縮功能的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。我們實(shí)驗(yàn)組運(yùn)用修飾后的硅酮彈性體作為三維支架與C2C12細(xì)胞共培

4、養(yǎng)獲取極性肌管。硅酮彈性體(Sylgard 184)有柔性基底層特征,表面光滑并具有一定的彈性,便于檢測細(xì)胞移動和加載產(chǎn)生的牽拉力[5]。
　　 前期的實(shí)驗(yàn)篩選了sylgard 184支架修飾包被的最佳基質(zhì)材料,使成肌細(xì)胞與基質(zhì)材料具良好相容性；并掌握細(xì)胞在材料表面的增殖、分化特性,初步探索了體外構(gòu)建肌組織的可能性。在此基礎(chǔ)上我們將進(jìn)一步完善骨骼肌的體外三維構(gòu)建,優(yōu)化極性平行肌管培養(yǎng)方法,改善Sylgard 184鑄槽技術(shù)。通過

5、修飾后的鑄槽對分化期C2C12細(xì)胞的極性誘導(dǎo)、促分化、促延展作用,獲取高密度、極性分化、具備收縮蛋白和生肌轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)能力的肌管,使其結(jié)構(gòu)更接近在體生理狀態(tài),并檢測分析Sylgard 184三維基質(zhì)材料對成肌干細(xì)胞生長分化的影響。為更優(yōu)化體外肌組織類似物的構(gòu)建,我們嘗試應(yīng)用具良好生物相容性、降解特性、在組織工程研究領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用的生物支架材料PGA與C2C12進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng),探討體外相容性和構(gòu)建的可行性。同時進(jìn)行三維和傳統(tǒng)平面培養(yǎng)兩種不

6、同的培養(yǎng)方法獲取肌管,檢測成肌轉(zhuǎn)錄因子和生肌標(biāo)志蛋白表達(dá),從成肌特性、收縮功能等方面進(jìn)行分析,比較研究三維與平面培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)及功能差異,為下一步的三維肌組織構(gòu)建和應(yīng)力拉伸研究提供理論和技術(shù)支持。這種體外培養(yǎng)三維極性肌管成分比較單一,可以避免其他因素的干擾,是研究肌細(xì)胞和肌組織自身功能活性的良好模型,有助于我們了解細(xì)胞發(fā)育中的一些基本原理。所構(gòu)建的肌組織模型進(jìn)一步研究有望能夠替代體外骨骼肌組織,加載相應(yīng)處理因素,為各種肌病的病因研究模擬病

7、理學(xué)條件。
　　 我們的主要研究內(nèi)容
　　 第一章硅酮彈性體(sylgard 184)三維基質(zhì)材料對成肌干細(xì)胞生長分化的影響
　　 [目的]
　　 鑄型并修飾的Sylgard 184與C2C12細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)獲取三維極性肌管并檢測分析硅酮彈性體三維基質(zhì)材料對成肌干細(xì)胞生長分化的影響。
　　 [方法]
　　 sylgard 184雙組分以10:1的比例均勻混合,倒入6孔板中,半固化時對Sylg

8、ard 184表面進(jìn)行壓痕鑄型,每條鑄槽長25ram,寬0.8mm,深1mm,置生物安全柜完全固化,Matrigel和膠原混合液均勻鋪被凹槽底部,紫外線照射備用。接種密度為1x106/ml的C2C12細(xì)胞懸液,細(xì)胞融合80％時,加入含2％馬血清的DMEM/F12分化培養(yǎng)以獲取極性肌管。倒置顯微鏡、HE染色觀察肌管的分化狀態(tài)及結(jié)構(gòu),RT-PCR、免疫熒光檢測。
　　 [結(jié)果]
　　 Sylgard 184凹槽表面生長的C2

9、C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化10d后,鏡下可見融合為多核、極性生長的肌管；20d時可見肌管明顯增粗、成熟、極性平行分布,相互融合形成肌組織類似物,有自主收縮性。HE染色可見平行的肌管內(nèi)有大量細(xì)胞核存在,PCR檢測到MyoD、Myogenin mRNA陽性表達(dá)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測極性肌管內(nèi)分化特異性標(biāo)志蛋白Myogenin、成肌特異性蛋白F-actin、MHC表達(dá)密集,表明構(gòu)建的肌組織類似物有成肌特征和收縮性。
　　 [結(jié)論]
　　

10、鑄型的Sylgard 184凹槽具有一定的方向引導(dǎo)效應(yīng),復(fù)合培養(yǎng)C2C12細(xì)胞,能誘導(dǎo)分化形成多核、重疊、極性肌管。實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)修飾的Sylgard 184三維支架為成肌干細(xì)胞提供賴以寄宿、增殖和分化的場所,具有良好的生物相容性,能增進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖,引導(dǎo)多核肌管極性生長,促進(jìn)肌樣分化,誘導(dǎo)組織再生,所獲得的骨骼肌組織類似物具有肌組織的生物學(xué)特性,其結(jié)構(gòu)更接近在體生理狀態(tài)。為下一步成功構(gòu)建較大體積的體外三維肌組織模型奠定基礎(chǔ)。

11、　　 第二章聚羥基乙酸(PGA)與成肌干細(xì)胞的體外相容性研究
　　 [目的]
　　 觀察成肌干細(xì)胞在聚羥基乙酸(PGA)上的粘附生長情況及在體外形成肌組織類似物的能力。
　　 [方法]
　　 將松散的PGA纖維纏繞固定在蓋玻片表面,確保纖維的平行排列和維持一定的張力。PGA纖維束長3cm,直徑約0.2cm。碘酒、乙醇浸泡消毒,0.1％PBS沖洗,Ⅰ型膠原和Matrigel混合物包被,紫外線消毒30min

12、。加入含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,置37℃5％CO2孵箱預(yù)培養(yǎng)3d。接種C2C12細(xì)胞濃懸液,與PGA材料進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)、分化,掃描電鏡下觀察C2C12細(xì)胞與PGA的粘附生長情況。
　　 [結(jié)果]
　　 PGA纖維束接種C2C12細(xì)胞后,倒置顯微鏡下可見細(xì)胞生長狀態(tài)良好,均勻粘附于纖維表面及空隙中,細(xì)胞橢圓至梭形,沿PGA纖維縱軸方向向兩極伸展,與材料相容良好,PGA纖維與貼壁生長的細(xì)胞之間無間隙和距離。分化培

13、養(yǎng)7d后,對分化形成的肌組織類似物行掃描電鏡,可見PGA纖維表面有較多的貼附生長的成肌細(xì)胞,肌管沿PGA平行排列方向生長,融合形成膜狀結(jié)構(gòu),細(xì)胞基質(zhì)分泌旺盛,肌管的分化不均一,長短、直徑不一致,分化肌管存活良好。成肌干細(xì)胞與PGA纖維有較好的生物相容性。
　　 [結(jié)論]
　　 PGA是目前應(yīng)用最為廣泛的組織工程支架材料,其良好的生物相容性、降解特性和體內(nèi)良好歸宿,獲得組織工程研究者的青睞。由于PGA纖維能夠平行排列成束,

14、有極性誘導(dǎo)效應(yīng),且細(xì)胞懸液易于滲透,有利于成肌干細(xì)胞的體外生長和極性分化。掃描電鏡初步證實(shí)了成肌細(xì)胞在PGA表面的良好生物相容性和極性分化潛能,肌管極性生長,融合成肌膜狀結(jié)構(gòu),表明PGA纖維作為支架材料用于體外肌組織構(gòu)建的可行性。
　　 第三章成肌干細(xì)胞體外三維及平面培養(yǎng)的比較研究
　　 [目的]
　　 比較三維與平面培養(yǎng)C2C12細(xì)胞形態(tài)及功能差異。
　　 [方法]
　　 Ⅰ型膠原和Matrig

15、el Matrix修飾Sylgard 184鑄槽和普通培養(yǎng)皿,分別接種C2C12細(xì)胞懸液,細(xì)胞增殖至80％融合時,換含2％馬血清的DMEM/F12誘導(dǎo)分化獲取成熟的肌管；倒置顯微鏡觀察肌管形態(tài),RT-PCR方法檢測MyoD、Myogenin基因mRNA的表達(dá),免疫熒光檢測成肌特異性蛋白MyoD、Myogenin、Desmin、F-actin、MHC和nAChR等的表達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 Sylgard 184鑄槽表

16、面的C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化5d,倒置顯微鏡下可見肌管融合多核、極性生長趨勢；17d后肌管增粗成熟、極性平行,融合形成肌組織類似物,有自主收縮性；掃描電鏡見肌管之間排列緊密、重疊,厚0.3mm,具有三維性；而平面培養(yǎng)分化3d后倒置顯微鏡下可見肌管融合,分化7d達(dá)成熟峰值,肌管小而排列紊亂。RT-PCR檢測三維和平面培養(yǎng)MyoD、Myogenin mRNA均陽性表達(dá),但三維培養(yǎng)的表達(dá)更強(qiáng)；MyoD、Myogenin、Desmin、F-act

17、in、MHC和nAChR等特異性蛋白檢測顯示,極性肌管內(nèi)熒光蛋白的表達(dá)更密集。
　　 [結(jié)論]
　　 相對于傳統(tǒng)的平面培養(yǎng),三維極性肌管的生存時間、功能表達(dá)、肌管間的細(xì)胞連接更加優(yōu)化。三維培養(yǎng)有較高的細(xì)胞成活率、肌管呈極性平行分布特征,有利于成肌細(xì)胞的體外極性分化和肌管間細(xì)胞連接的形成,肌管存活時間長且一管多核,有利于成肌分化因子和收縮蛋白的表達(dá),其結(jié)構(gòu)更接近其生理狀態(tài),且無其他細(xì)胞或組織成分的干擾,肌管純度高并具備自主