精原干細(xì)胞在成骨培養(yǎng)條件下生物學(xué)特征的研究.pdf

1、目的： 1.對(duì)小鼠精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)的體外培養(yǎng)方法進(jìn)行研究，觀察SSCs體外的增殖能力及生物學(xué)特性，并對(duì)細(xì)胞表面相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，以期建立體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞的培養(yǎng)體系，為精原干細(xì)胞深入研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?2．觀察小鼠精原干細(xì)胞在成骨培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特征，初步探討其可能機(jī)制，為研究精原干細(xì)胞的多向分化能力奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)可為其作為組織工程種子細(xì)胞提供初步的實(shí)驗(yàn)依

2、據(jù)。 方法： (1)骨髓基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層制備：用全骨髓法分離小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞。選取生后7～10 d昆明系小白鼠(雌雄不限)，無(wú)菌條件下取出脛骨、股骨，分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞，差速貼壁法進(jìn)行純化。以含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)6～7 d后細(xì)胞鋪開(kāi)成單層占瓶底達(dá)80％，換用含終濃度為10μg/ml絲裂霉素C的IMDM培養(yǎng)基處理，充分清洗后作為飼養(yǎng)層備用。 (2)精原干細(xì)胞的純化培養(yǎng)及其鑒定：通過(guò)兩步酶消化法從

3、新生小鼠睪丸中收集睪丸細(xì)胞并培養(yǎng)。無(wú)菌取出生后6～8 d雄性小鼠雙側(cè)睪丸，去白膜，隨后用1mg/ml IV型膠原酶37℃消化10 min，其間不斷搖動(dòng)，直到生精小管散開(kāi)，PBS清洗后，然后用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA在顯微鏡下控制消化時(shí)間，見(jiàn)生精小管段被解離成單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)時(shí)，用含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基終止消化，Hanks液清沈后，收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種在用0.2％明膠包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃，

4、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在1h、3 h、12 h經(jīng)差速貼壁法去除非精原干細(xì)胞，收集較純的精原干細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液接種于上述制備好的骨髓基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層中進(jìn)行培養(yǎng)；另外，接種前將少許細(xì)胞懸液滴片，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)精原干細(xì)胞的標(biāo)志物Thy-1。接種培養(yǎng)后在倒置相差顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖特征，且對(duì)培養(yǎng)3d的精原干細(xì)胞用同法檢測(cè)表面標(biāo)記分子Thy-1。 (3)精原干細(xì)胞在成骨培養(yǎng)條件下培養(yǎng)：取培養(yǎng)3 d的精原干細(xì)胞，用

5、0.25％的胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，將其加入24孔培養(yǎng)板中，每孔加入濃度為5×104/ml的細(xì)胞懸液1ml培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分組進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照組：用一般培養(yǎng)液(IMDM+100 U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素+10％胎牛血清)培養(yǎng)精原干細(xì)胞，3～4 d換液1次。實(shí)驗(yàn)組：用成骨條件培養(yǎng)液(一般培養(yǎng)液中添加50 mmol/L β-甘油磷酸鈉，10-6mol/L地塞米松，50mg/L維生素C，50 nmol/L胰島素，20 nmol

6、/LbFGF)誘導(dǎo)培養(yǎng)精原干細(xì)胞，3～4 d換液1次。 (4)結(jié)果檢測(cè)：在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并照相記錄；特定時(shí)間段對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析細(xì)胞增殖行為；紫外分光光度儀動(dòng)態(tài)檢測(cè)培養(yǎng)上清液的堿性磷酸酶活性(Alkaline phophatase，ALP)；免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)I型膠原的表達(dá)。(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用配對(duì)設(shè)計(jì)的均數(shù)t檢驗(yàn)對(duì)堿性磷酸酶活性檢測(cè)所得資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： (1)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞

7、呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，突起相互交織，6～7 d后鋪展開(kāi)成單層達(dá)瓶壁底80％，經(jīng)絲裂霉素C處理后不再分裂增殖但保留了分泌功能； (2)精原干細(xì)胞在骨髓基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)3 d后開(kāi)始增殖，增殖的細(xì)胞呈鏈狀、簇狀、克隆樣生長(zhǎng)，細(xì)胞間可見(jiàn)明顯的由于細(xì)胞未完全分裂形成的胞質(zhì)間橋。精原干細(xì)胞接種培養(yǎng)前滴片及培養(yǎng)3 d后，檢測(cè)其表面標(biāo)記分子Thv-1均呈陽(yáng)性反應(yīng)，且陽(yáng)性率達(dá)90％以上。細(xì)胞的以上生長(zhǎng)特點(diǎn)、形態(tài)學(xué)特征及免疫組化檢測(cè)均與精原干細(xì)胞

8、的特性符合。 (3)形態(tài)學(xué)特征變化：對(duì)照組SSCs從第3 d開(kāi)始分裂增殖，第6 d增殖細(xì)胞呈簇狀、鏈狀生長(zhǎng)，9 d后細(xì)胞增殖加快，12 d后細(xì)胞增殖速度明顯增加，SSCs分裂形成的每個(gè)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞數(shù)可達(dá)20個(gè)左右，在這些增殖的細(xì)胞中，細(xì)胞間橋仍明顯；實(shí)驗(yàn)組SSCs在條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每時(shí)間段的細(xì)胞增殖均較對(duì)照組快，生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞，呈集落樣生長(zhǎng)，12 d時(shí)細(xì)胞增殖達(dá)高峰，增殖細(xì)胞之間缺乏明顯的連接，未見(jiàn)到明顯的胞質(zhì)間橋；細(xì)胞的形態(tài)

9、呈現(xiàn)幼稚性細(xì)胞的變化，核質(zhì)比例大。 (4)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行Ⅰ型膠原免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，呈陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)照組呈陰性。 (5)培養(yǎng)上清液中的堿性磷酸酶活性：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組開(kāi)始都很低，以后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，且實(shí)驗(yàn)組每時(shí)間段均高于對(duì)照組。應(yīng)用配對(duì)設(shè)計(jì)的均數(shù)t檢驗(yàn)對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，(t=3.441，P=0.026<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： (1)以原代培養(yǎng)的小鼠