豬圓環(huán)病毒2型懸浮培養(yǎng)規(guī)模化生產(chǎn)工藝初探.pdf

1、豬圓環(huán)病毒相關(guān)性疾病(PCVAD)是指斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PNDS)、豬呼吸系統(tǒng)混合疾病及繁殖障礙的總稱。研究證明，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起PCVAD的主要病原體。豬對(duì)PCV2具有較強(qiáng)易感性，而且傳播途徑多樣。本病無(wú)特效的治療方法，對(duì)豬進(jìn)行疫苗接種是預(yù)防豬圓環(huán)病毒2型感染的有效手段。目前養(yǎng)殖場(chǎng)使用較多的疫苗包括亞單位疫苗、嵌合病毒滅活疫苗及全病毒滅活疫苗。PCV2全病毒滅活疫苗需要突破的工藝難

2、點(diǎn)是圓環(huán)病毒的培養(yǎng)。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝，由于受細(xì)胞增殖面積、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)及氣體交換等條件的限制，病毒增殖數(shù)量較少，導(dǎo)致下游工藝需要進(jìn)行病毒濃縮才能達(dá)到配苗標(biāo)準(zhǔn)，然而濃縮工藝會(huì)造成雜蛋白富集，增加免疫應(yīng)激的比例，不能有效滿足養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)該疫苗的需求。在PCV2全病毒滅活疫苗研究中引入微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)，可以提高單位體積內(nèi)的細(xì)胞量和產(chǎn)毒量，從有效性、穩(wěn)定性和安全性等多方面對(duì)疫苗質(zhì)量進(jìn)行提升。
　　本研究應(yīng)用生物反應(yīng)器對(duì)PCV2的微載體懸浮培養(yǎng)

3、進(jìn)行了系統(tǒng)研究。對(duì)PCV2增殖的豬腎細(xì)胞（PK-15A）的懸浮培養(yǎng)工藝進(jìn)行了研究，優(yōu)化微載體使用濃度、細(xì)胞接種量、細(xì)胞初始攪拌方式、生長(zhǎng)階段攪拌速度和培養(yǎng)基補(bǔ)給方式等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。優(yōu)化反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞消化參數(shù)，摸索并建立該細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)的消化工藝。優(yōu)化病毒接種劑量(MOI)、維持液血清濃度、溶氧參數(shù)及培養(yǎng)溫度參數(shù)。
　　細(xì)胞培養(yǎng)工藝:確定載體濃度為3g/L，細(xì)胞接種量為10cells/micro-carrier，初始接種攪拌參數(shù)為加

4、入細(xì)胞后補(bǔ)充培養(yǎng)基至1/3培養(yǎng)體積、初始轉(zhuǎn)速為20r/min、培養(yǎng)2h后補(bǔ)足培養(yǎng)體積，攪拌速度設(shè)為30r/min，培養(yǎng)基補(bǔ)給方式為培養(yǎng)2日換一半營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，培養(yǎng)細(xì)胞峰值達(dá)到1.5×106-2×106cells/mL。消化工藝:PBS清洗2次，每次1L清洗液，微載體上消化脫落的細(xì)胞超過(guò)85％，達(dá)到預(yù)期效果。病毒培養(yǎng)工藝:0.1MOI、2％血清濃度的維持液、40％溶氧量、37℃，連續(xù)培養(yǎng)收獲至F9維持液，自F2起，各代次維持液的病