毛竹三個全長LTR轉(zhuǎn)座子的分布、進(jìn)化模式分析及PHRE5的克隆與功能鑒定.pdf

1、LTR轉(zhuǎn)座子以高拷貝在植物中廣泛存在，對植物基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化起著重要的作用。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)，分析和鑒定了毛竹中的3個LTR(long terminal repeat，LTR)轉(zhuǎn)座子，分別命名為PHRE3(Phyllostachys edulis retrotransposons3)、PHRE4(Ph.edulis retrotransposons4)和PHRE5(Ph.edulis retrotransposons5)

2、。選取PHRE5為對象，研究了不同脅迫處理對PHRE5轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)變化的影響及插入多態(tài)性。
　　1.利用公布的毛竹基因組數(shù)據(jù)庫，通過LTR-STRUC軟件查找基因組中具有完整結(jié)構(gòu)的LTR轉(zhuǎn)座子，選取了三個結(jié)構(gòu)完整的LTR轉(zhuǎn)座子(PHRE3、PHRE4和PHRE5)為研究對象。通過生物信息學(xué)技術(shù)手段系統(tǒng)分析了這三個轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)、在基因組的分布及進(jìn)化模式。PHRE3轉(zhuǎn)座子在毛竹基因組中全長13160bp，有全長序列37個，solo-L

3、TR21個，截斷分子5237個，具備轉(zhuǎn)座需要的5種酶基因，分別是GAG(Group-specific antigen)、PAP(Pepsin-like aspartate proteases)、RT(Reverse transcriptases)、RH(Ribonuclease H)及INT(Integrase)，屬于Ty3-gypsy家族成員;具備兩端LTR序列、PB S(Prime bingding site)及PPT(Polypu

4、rine tract);上游偏好插入在TNNNNN(A/T)(T/C)GN(T/C)(A/C)T位置，下游偏好插入在ANNNNA(G/A)N(A/G)T(A/C)GT;LTR兩端的序列同源性95.40％，插入時間約在146.2萬年前。PHRE4轉(zhuǎn)座子在毛竹基因組中全長5471bp，有全長序列3個，solo-LTR2個，截斷分子46個，具備轉(zhuǎn)座需要的5種酶基因GAG、PAP、RT、RH及INT，屬于Ty3-gypsy家族;具備兩端LTR序

5、列、PBS及PPT位點(diǎn);上游偏好插入在T(T/G/C)(A/G)(C/A)(G/C/A)(T/C/A)(T/G/A)(T/A)(G/T/C)(C/A)(G/A)A(T/A)(G/T/C)(T/C)(T/G/C)(T/G/C)C位置，下游偏好插入A(T/G/C)(C/T)CAG(T/A)T(C/A)(C/G/A)(G/T/G)A(G/C)A;LTR兩端的序列同源性99.45％，插入時間約在23.1萬年前。PHRE5轉(zhuǎn)座子在毛竹基因組中全長

6、5774bp，有全長序列2個，solo-LTR1個，截斷分子45個，具備轉(zhuǎn)座需要的5種酶基因GAG、PAP、RT、RH及INT，屬于Ty3-gypsy家族成員;具備兩端LTR序列、PBS及PPT;上游偏好插入在C(T/A)(C/T/A)NA(G/T)TC(T/A)(A/C)(G/C)(A/G)(G/C)N(G/T)(G/T)(T/G)(G/T)A位置，下游偏好插入在CCAC(C/T)(C/G)(A/T)(A/G)(A/T)(C/T)(C

7、/G)A(T/C)C(A/T)T(T/A)C;LTR兩端的序列同源性99.26％，插入時間約在26.9萬年前。
　　2.根據(jù)具有轉(zhuǎn)座活性的LTR轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化特征，選取了可能具活性的PHRE5轉(zhuǎn)座子為研究對象，分析了它在毛竹實(shí)生苗、毛竹多倍體、毛竹變種及栽培種中的拷貝數(shù)變化。首先將毛竹種子進(jìn)行不同脅迫（γ射線輻射，DNA甲基化抑制劑）處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn):50Gy、70Gy和90Gy劑量的輻射可使毛竹PHRE5轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)增加，而

8、在低劑量(10Gy)或高劑量(110Gy、130GY)的輻射下轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)基本不變;50μmol/l、100μmol/l、150μmol/l、200μmol/l、250μmol/l濃度的DNA甲基化抑制劑處理后毛竹轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)增加，而低濃度（25μmol/l）或高濃度(500μmol/l)的DNA甲基化抑制劑處理，轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)基本不變;四倍體PHRE5轉(zhuǎn)座子實(shí)生苗拷貝數(shù)最高約增加到野生型的2.5倍，六倍體單株實(shí)生苗PHRE5拷貝數(shù)只增加

9、到野生型的2.5倍。
　　3.為了進(jìn)一步檢測PHRE5插入多態(tài)性，本實(shí)驗(yàn)利用LAPCR體外克隆技術(shù)，通過非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測毛竹PHRE5轉(zhuǎn)座子的多態(tài)性。結(jié)果表明，這兩個轉(zhuǎn)座子在50Gy、70Gy、90Gy輻射，50μmol/l、100μmol/l、150μmol/l、200μmol/l、250μmol/l濃度的DNA甲基化抑制劑處理及多倍體幼苗都具有一定的多態(tài)性。
　　4.毛竹在栽培過程中產(chǎn)生很多表型變化，如桿形、

10、桿色及葉色變化等，這些表型特征不穩(wěn)定，環(huán)境變化時還會發(fā)生回復(fù)突變。為探索轉(zhuǎn)座子與表型變化之間的關(guān)系，本研究選取了8種毛竹變種為試驗(yàn)材料，分析了PHRE5的拷貝數(shù)和多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生毛竹相比，變種中PHRE5轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)都有所增加，并具有一定的插入多態(tài)性。但是PHRE5的插入多態(tài)性是否與表型變化有關(guān)系，還需要更多的研究。
　　本課題通過人工脅迫處理人為地激活毛竹中具有潛在活性的LTR轉(zhuǎn)座子，為研究LTR轉(zhuǎn)座子與毛竹基因組進(jìn)化的