回腸轉位術對非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代謝作用及機制研究.pdf

1、目前全球有2.8億糖尿病患者，發(fā)病率逐年升高，并且表現(xiàn)出年輕化趨勢，其中90％是2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)，僅美國就有2800萬2型糖尿病患者，占到總人口7％。在2007年糖尿病死亡率位列第七位。目前研究認為2型糖尿病的發(fā)病是多因素的結果，尤其是以遺傳及不良生活習慣為主，而內科相關治療手段，如增加運動量、限制食物攝取、使用降糖藥物及胰島素等，均不能使其根除。由于需要長期堅持治療甚至維持終生，患者依

2、從性差，使血糖水平不能維持在正常水平范圍之內，導致各種并發(fā)癥的發(fā)生。2型糖尿病長期血糖控制不佳除了引起失明、腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及孕期并發(fā)癥外，還要面對持續(xù)高發(fā)的由于心肌梗死導致的充血性心力衰竭和死亡，而擴張性心肌病的發(fā)病率越來越高，有研究表明大約有60％的2型糖尿病患者表現(xiàn)心肌收縮功能的失調。糖尿病患者消耗大量公共醫(yī)療資源，醫(yī)療費用是正常非糖尿病患者的兩到三倍。美國每年為糖尿病患者投入1740億美元，預計到2020年要增加到1920億美

3、元，其中67％直接與糖尿病相關。因此，尋找安全、長效、依從性高的治療方法成為全球關注的熱點，而關于2型糖尿病相關治療機制值得深入探討。
　　 減肥手術（Bariatricsurgery）作為研究熱點，有越來越多的研究針對各種手術方式、短期或長期的葡萄糖穩(wěn)態(tài)的改善而進行。目前研究認為，減肥手術后患者通過能量攝入減少及胰島素相關胃腸道激素的分泌變化而改善血糖內穩(wěn)態(tài)，最終起到血糖控制的作用。回腸轉位術(Ilealtranspositi

4、on，IT)的理念首次在1982年被KoopmansHS等人在肥胖動物實驗模型中提出。而此術式首先在非肥胖型2型糖尿病大鼠中與其他術式（如胃旁路術，膽胰轉流術等）相比有效的縮短了手術操作以及術后恢復時間。另外，血糖控制改善常常發(fā)生于體重明顯減輕之前，預示手術在2型糖尿病改善中的直接作用，而不是繼發(fā)于體重減輕和肥胖消除。這些發(fā)現(xiàn)揭示了遠端回腸內分泌激素機制可能參與了術后非肥胖2型糖尿病的恢復。同時，胰高血糖素樣肽(Glucagon-lik

5、epeptide-1，GLP-1)作為有效的胰島素釋放促進劑，已經(jīng)被實驗證實可以促進正常和缺血再灌注后心臟的葡萄糖攝取?；啬c轉位術延遲了近端腸管與攝入食物的接觸而促進回腸與食物接觸，保持了腸管的完整性，促進GLP-1的分泌，越來越多的實驗證據(jù)為回腸轉位術在促進2型糖尿病心肌胰島素信號通路及葡萄糖轉運改善方面提供可能。
　　 為研究回腸轉位術對心肌糖代謝功能、胰島素信號通路及葡萄糖轉運可能的作用及機制，本課題采用自發(fā)性非肥胖2型糖

6、尿病Goto-Kakizaki(GK)大鼠為動物模型，首先確定GK大鼠在心肌糖代謝、胰島素信號及葡萄糖轉運方面的變化，行回腸轉位術并監(jiān)測術后系統(tǒng)性血糖內穩(wěn)態(tài)、胰島β細胞功能及胃腸道激素等變化，然后進一步研究心肌葡萄糖攝取及胰島素信號通路重要蛋白，并行體外心肌細胞培養(yǎng)，以期為手術治療2型糖尿病改善心血管并發(fā)癥提供理論支持及治療依據(jù)。
　　 第一部分、非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代謝及胰島素信號變化
　　 非肥胖2型糖尿病GK

7、大鼠作為自發(fā)性糖尿病大鼠模型，表現(xiàn)輕度血糖升高，葡萄糖刺激的胰島素分泌功能受損，明顯的葡萄糖不耐受，外周胰島素抵抗，這些都可能導致心肌受損。我們首先驗證了GK大鼠心肌葡萄糖攝取功能，胰島素信號及葡萄糖轉運的變化。
　　 1.GK大鼠心肌胰島素刺激的葡萄糖攝取顯著低于對照鼠
　　 為研究心臟葡萄糖攝取的情況，我們收集各30只，8-10周齡GK大鼠及其對照大鼠Sprague-Dawley(SD)大鼠的新鮮心臟，首先進行心臟L

8、angendorff灌注清洗殘余血跡，然后在含有2D-3H-glucose的Krebs-Ringer's緩沖液中孵育一段時間后，加入胰島素或者對照試劑刺激，最終檢測心肌的葡萄糖攝取量。結果顯示在沒有胰島素刺激（對照試劑）的情況下，GK大鼠心肌細胞的葡萄糖攝取與對照組無異;但是胰島素刺激可以大大促進大鼠心肌的葡萄糖攝取，而GK大鼠心肌葡萄糖攝取量明顯低于對照組。提示GK大鼠心肌葡萄糖攝取功能受損。
　　 2.GK大鼠心肌胰島素信號

9、通路變化
　　 胰島素與胰島素受體(InsulinReceptor,IR)的結合可以引起胰島素信號通路一些列酪氨酸殘基的自身磷酸化，這些磷酸化的酪氨酸殘基可以被其銜接蛋白的ProteinTyrosineBindingdomain(PTB)結構域識別，這其中以胰島素受體底物（InsulinReceptorSubstrate，IRS）蛋白為代表，這個過程引起了IRS蛋白重要酪氨酸殘基的磷酸化，從而導致被Phosphoinositid

10、e3-kinases(PI3K)等脂質激酶激活而結合。本研究著重于此信號通路的重要蛋白的mRNA及總蛋白表達，各自的磷酸化及IRS-1結合的PI3K。我們收集胰島素或者葡萄糖刺激的GK大鼠及SD大鼠的新鮮心臟，提取總mRNA及蛋白質，利用RT-PCR、免疫印跡(Westernblot)及免疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation，Co-IP)檢測IR-β、IRS-1及其酪氨酸磷酸化、Akt(ProteinKinaseB)

11、總蛋白和磷酸化蛋白，以及胰島素刺激的IRS-1結合的PI3K蛋白總量的表達。
　　 2.1、胰島素受體β(IR-β)mRNA、總蛋白及其磷酸化蛋白表達降低
　　 胰島素受體作為跨膜的大分子蛋白，分為α、β兩個亞基，胰島素信號通路的激活，首先需要與α亞基結合而發(fā)生構型變化，導致跨膜的β亞基酪氨酸磷酸化，從而引起下游一系列信號的激活。故IR-β的總量與其磷酸化在胰島素信號通路中起重要作用。本研究通過RT-PCR、Wester

12、nblot及免疫共沉淀等試驗證實在GK大鼠心臟中IR-βmRNA、蛋白總量及酪氨酸磷酸化降低，提示其心肌胰島素受體水平的降低，從而預示心肌胰島素信號可能存在受損情況。
　　 2.2、胰島素受體底物-1(IRS-1)mRNA、總蛋白及其磷酸化蛋白表達降低
　　 胰島素受體底物也與胰島素受體后水平的調節(jié)有關，其中IRS-1主要作用于橫紋?。ü趋兰　⑿募。鳬RS-2則廣泛作用于肝臟、脂肪及骨骼肌等。有研究證實在IRS-1-

13、/-動物模型中，動物出現(xiàn)嚴重的胰島素外周抵抗，證實IRS-1在胰島素信號通路中的作用。本研究通過RT-PCR、Westernblot及Co-IP等試驗證實在GK大鼠心臟中胰島素受體底物mRNA、蛋白總量及酪氨酸磷酸化降低。胰島素受體后水平的降低，提示心肌胰島素受體酪氨酸激酶活化后的環(huán)節(jié)障礙。
　　 2.3、胰島素刺激的IRS-1/PI3K/Akt蛋白信號通路抑制
　　 IRS-1與PI3K蛋白的結合是胰島素發(fā)生代謝作用的

14、主要途徑。而胰島素受體/IRS/PI3K信號通路障礙，勢必引起下游代謝受影響。本研究通過新鮮心臟組織Co-IP實驗證實GK大鼠心臟中IRS-I/PI3K結合明顯降低，提示心肌胰島素代謝作用受損。
　　 Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又被稱蛋白激酶B(PKB)。作為IRS/PI3K信號通路下游的靶蛋白，其主要通過激活細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)來誘導細胞周期進展;對于細胞葡萄糖攝取方面，其通過增加葡萄糖轉運因子4(GLU

15、T4)的活性來實現(xiàn)，最終促進細胞生長;Akt活化后還可磷酸化糖原合成激酶3(GSK3)促進糖原合成，并可增加細胞無氧糖酵解水平。其對胰島素葡萄糖代謝起著重要作用，其磷酸化水平與其活性密切相關。本研究通過RT-PCR、Westernblot及Co-IP等實驗證實在GK大鼠心臟中Akt蛋白總量未變，而酪氨酸磷酸化降低，Akt活性的降低提示IRS/PI3K下游通路受損。
　　 3.GK大鼠葡萄糖轉運蛋白表達變化
　　 葡萄糖轉

16、運蛋白是細胞轉運葡萄糖的載體，其中葡萄糖轉運蛋白-1(GLUT1)廣泛的表達于各種組織，可以調節(jié)葡萄糖的攝取并且具有較強的親和力;而GLUT4主要表達與脂肪組織和橫紋肌中（主要有心肌和骨骼?。谝葝u素刺激的情況下，能夠有效的將葡萄糖及自身從細胞漿轉運到細胞膜上，從而促進胰島素刺激的葡萄糖轉運。有研究表明在Akt及PI3K都可以促進GLUT4的易位。為進一步研究GK大鼠葡糖糖代謝通路的變化，本研究收集大鼠的新鮮心肌，提取組織總mRNA、

17、總蛋白及膜蛋白，采用RT-PCR、Westernblot方法，檢測葡萄糖轉運蛋白1及葡萄糖轉運蛋白4的表達。結果證實葡萄糖轉運蛋白1及葡萄糖轉運蛋白4蛋白表達總量與對照鼠一致，而葡萄糖轉運蛋白4膜蛋白表達量明顯低于對照組SD大鼠，提示GK大鼠心肌葡萄糖轉運能力下降。
　　 第二部分、回腸轉位術對非肥胖2型糖尿病大鼠血糖穩(wěn)態(tài)及心肌葡萄糖糖攝取作用
　　 回腸轉位術是將遠端10cm回腸切除并吻合到近端空腸，人為復制如Roux

18、-en-Y胃旁路術(RYGB)和膽胰轉流術(Biliopancreaticdiversion，BPD)手術后未消化的食糜提前到達接觸遠端回腸模型。此手術模型不會引起明顯的營養(yǎng)不良或胃容量限制而引起研究者的興趣。有研究顯示，回腸轉位術可以明顯促進鏈脲佐菌素誘導SD糖尿病大鼠的胰島素分泌，并且顯著增加血清腸內分泌激素，如GLP-1、多肽YY激素(PYY)等濃度;也有試驗顯示回腸轉位術后早期（10-45天）非肥胖型糖尿病大鼠胰島素抵抗得到改善

19、。為驗證遠端回腸在早期及長期葡萄糖耐受、血糖內穩(wěn)態(tài)及胰島β細胞功能改善方面是否起作用，并且與動物攝食及體重的改變的關系;同時，為探索回腸轉位術在心肌葡萄糖攝取的作用，本研究采用非肥胖2型糖尿病GK大鼠進行回腸轉位術并進行一系列相關指標的探索。
　　 1.動物模型的評價
　　 雄性8-10周齡GK大鼠及相應同齡SD大鼠，術前常規(guī)檢測進食量、體重、空腹血糖濃度，評估糖尿病模型及對照組的穩(wěn)定性，其中空腹血糖≥7.0mmol/L

20、，2h血糖≥11.1mmol/L的GK大鼠分為糖尿病手術組與糖尿病假手術組，SD大鼠皆為非糖尿病對照組。
　　 1.1、術前手術組與假手術組評價
　　 常規(guī)術前檢測糖尿病手術組與糖尿病假手術組食物攝取、體重、空腹血糖濃度、口服糖耐量實驗(OGTT)、胰島素抵抗(ITT)，同時監(jiān)測胰島素β細胞功能（餐前后血清胰島素、葡萄糖刺激的C肽）、胃腸內分泌激素(GLP-1、GIP、PYY)分泌量，發(fā)現(xiàn)術前手術組與假手術組皆沒有明顯差

21、異。
　　 1.2、術后手術組與假手術組評價
　　 1.2.1、各組動物手術評價
　　 常規(guī)記錄手術時間及成功率，觀察并嚴格記錄術后并發(fā)癥及恢復情況。兩組動物平均手術時間及術后恢復時間無明顯差異，手術成功率100％，其中手術組及假手術組各死亡2只，死亡率6.7％，死亡原因分別為術后腸梗阻及吻合口漏。該研究證明回腸轉位術與假手術相比，術式安全可靠。
　　 1.2.2、回腸轉位術對動物進食、體重、空腹血糖、口

22、服糖耐量及胰島素抵抗的影響
　　 術后常規(guī)多個時間點記錄動物食物攝取量，體重及空腹血糖濃度并行口服糖耐量實驗和胰島素抵抗實驗。結果顯示，術后動物攝食量第4周與假手術組出現(xiàn)明顯差異，體重在第8周出現(xiàn)差異。而血糖及糖耐量、胰島素抵抗改善都早于攝食和體重的改變，提示手術對于葡萄糖內穩(wěn)態(tài)的改善作用可能不依賴于體重和攝食量的變化。同時，通過6個月的檢測，手術組血糖維持穩(wěn)定，有顯著改善，故回腸轉位術對血糖的改善是長期（6個月）而穩(wěn)定的。

23、r>　　 1.2.3、回腸轉位術對胰島β細胞功能影響
　　 胰島β細胞功能是指胰島β細胞在葡萄糖的刺激下，分泌胰島素以保持穩(wěn)定的機體血糖水平的功能。測定胰島β細胞功能手段之一是測量血清胰島素含量和C肽水平。為了證實回腸轉位術在胰島素β細胞功能改善的作用，收集大鼠空腹或者胃灌注葡萄糖后血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清中胰島素及C肽水平。結果證實，回腸轉位術能夠促進血清胰島素及C肽分泌，改善胰島β細胞功能。

24、　　 1.2.4、回腸轉位術對胃腸激素分泌影響
　　 為了研究回腸轉位術對胃腸激素分泌的影響，本研究測定大鼠血清樣本中GLP-1、PYY及GIP的含量。有研究證實，胃旁路手術后血清GLP-1、PYY持續(xù)性明顯增加，而在動物實驗中，GLP-1已經(jīng)被證實能促進胰島素分泌，增加胰島β細胞的增殖和抑制其凋亡。GLP-1通過直接與胰島β細胞的受體直接結合而起作用;另有人體實驗證據(jù)表明，減肥手術后GLP-1的升高能引起較長期的高胰島素低血

25、糖狀態(tài);而關于PYY的動物減肥手術研究也證實其可以促進胰島β細胞功能的增強。GIP又稱為葡萄糖依賴性胰島素釋放肽，是一個42個氨基酸的多肽，主要由十二指腸和空腸黏膜細胞分泌。在高血糖狀況下其可以促進胰島β細胞分泌胰島素，目前關于其在肥胖和2型糖尿病減肥手術的生理功能研究不足。通過對照研究，發(fā)現(xiàn)術后血清GLP-1，PYY明顯較假手術組升高，但是GIP的分泌區(qū)別不大，預示GIP可能不是減肥手術后血糖穩(wěn)定改善的因素之一。
　　 2.回

26、腸轉位術對動物心肌細胞葡萄糖攝取的影響
　　 葡萄糖攝取的作為血糖內穩(wěn)態(tài)的重要指標。本研究采用術后離體新鮮大鼠心臟，灌注后胰島素刺激葡萄糖攝取，結果顯示術后短期葡萄糖攝取沒有明顯改善，而術后6個月對比手術組與假手術組，心肌細胞葡萄糖攝取功能明顯恢復。并且提示，回腸轉位術可能促進心肌胰島素信號及葡萄糖轉運功能。
　　 第三部分、回腸轉位術對非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代謝改善機制研究
　　 前期研究證明非肥胖2型糖尿

27、病大鼠心肌胰島素信號機葡萄糖轉運受損，而多篇文獻報道回腸轉位術在改善血糖內穩(wěn)態(tài)的作用，然而機制并未闡明。本研究第二部分研究發(fā)現(xiàn)回腸轉位術改善動物整體及心肌細胞的糖代謝，促進胰島β細胞功能改善及胃腸激素分泌，為了進一步闡明該手術對非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代謝改善的機制，本部分首先利用大鼠新鮮心臟及骨骼肌，采用Westernblot及免疫沉淀等分子生物學技術，對胰島素信號通路及葡萄糖轉運蛋白進行研究。同時，本部分分離非肥胖2型糖尿病GK大

28、鼠心肌細胞進行培養(yǎng)，行體外實驗，并使用GLP-1及其受體激動劑Ex-4刺激培養(yǎng)細胞，探索GLP-1在心肌胰島素信號及葡萄糖轉運代謝中可能存在的作用機制，為藥物及手術治療糖尿病提供可能的思路及理論支持。
　　 1.回腸轉位術對心肌胰島素信號的影響
　　 1.1、胰島素受體-β(IR-β)及其磷酸化蛋白表達增加
　　 術后6個月回腸轉位術組大鼠心臟IR-β明顯增加，并且磷酸化IR-β蛋白表達量與IR-β蛋白總量變化趨

29、勢相同，表明磷酸化蛋白增加可能與IR-β蛋白總量增加呈正相關，提示術后大鼠心肌胰島素信號存在改善。
　　 1.2、胰島素受體底物-1(IRS-1)及其磷酸化蛋白表達增加
　　 IRS-1及其磷酸化早在術后1個月即發(fā)生明顯變化，而術后6個月回腸轉位術手術組與假手術組中蛋白表達總量區(qū)別更明顯。
　　 1.3、胰島素刺激的IRS-1/PI3K蛋白信號通路改善
　　 IRS-1結合的PI3K活性增加被認為是胰島素

30、抵抗改善的重要指標之一。我們采用免疫共沉淀法檢測IRS-1結合的PI3K活性表達，通過對比術后1個月及6個月IRS-1結合的PI3K蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)術后1個月其表達量就有增加，而術后6個月IRS-1結合的PI3K增加更明顯，而術后1個月與6個月相比差別有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 2.回腸轉位術對心肌及骨骼肌細胞葡萄糖轉運蛋白的影響
　　 本課題測定骨骼肌及心肌組織中GLUT4總蛋白及細胞膜含量的表達。所有分組總

31、GLUT4表達量未見明顯區(qū)別。術后1個月細胞膜蛋白GLUT4表達量增加，而6個月后增加量更加明顯。
　　 3.GLP-1及其受體激動劑在GK大鼠體外心肌細胞培養(yǎng)中胰島素樣作用
　　 通過離體心肌細胞培養(yǎng)以及對照研究實驗，我們發(fā)現(xiàn)GLP-1及其受體激動劑Ex-4都存在擬胰島素樣作用，其可以促進葡萄糖攝取及IRS-1結合的PI3K活性增加。本研究從而通過體外實驗，證明第二部分中回腸轉位術增加的血清GLP-1的分泌，而血清GL