骨代謝標(biāo)志物(NTx)與大鼠骨轉(zhuǎn)移疼痛的關(guān)系研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　骨轉(zhuǎn)移疼痛是惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移患者的常見癥狀,嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。骨轉(zhuǎn)移疼痛由于經(jīng)常伴有爆發(fā)性疼痛,臨床上較為難治。目前對骨轉(zhuǎn)移疼痛的治療方法主要為非甾體抗炎藥、環(huán)氧化酶-2抑制劑、化療、放療、含氮的雙膦酸鹽類藥物以及阿片類藥物的單藥或多藥聯(lián)合治療。當(dāng)患者經(jīng)過上述治療后,如果仍然存在疼痛,甚至疼痛程度加重時,需要鑒別未控制疼痛的原因是由于腫瘤進展還是患者對治療藥物或方法無反應(yīng)或劑量不夠。而判斷骨轉(zhuǎn)移病變及

2、范圍的常規(guī)的影像學(xué)或放射性核素顯像無法精確定量骨損傷的量及速度。因此,需要一種簡單的并且能快速和敏感的發(fā)現(xiàn)骨骼改變的評估方法,以至于能連續(xù)的監(jiān)測患者的病情進展和評估藥物治療反應(yīng)。
　　近年來,骨膠原代謝產(chǎn)物——I型膠原交聯(lián)氨基末端肽(NTx)以及I型膠原交聯(lián)碳端肽(CTx)逐步被人們所關(guān)注。I型膠原是骨組織中唯一的膠原,占骨基質(zhì)的90％。研究顯示,NTx單獨起源于I型膠原,并在骨吸收階段被破骨細胞激活而產(chǎn)生成一個新的表位,具有較高

3、特異性,是破骨細胞溶骨性改變的直接產(chǎn)物,并不會繼續(xù)代謝。通過采集血清或尿液標(biāo)本均可分析NTx水平,其中尿液檢測無創(chuàng)且易于收集,能反復(fù)多次進行,有利于對患者的骨病變進展和疼痛治療反應(yīng)進行連續(xù)監(jiān)測。
　　因此,本研究旨在探尋大鼠尿NTx及NTx的增長速度是否與骨轉(zhuǎn)移疼痛及程度相關(guān)。并進一步探討NTx與大鼠骨轉(zhuǎn)移瘤的化療、雙膦酸鹽治療的關(guān)系,從而判斷尿NTx是否能成為早期發(fā)現(xiàn)骨病變進展和評估藥物疼痛治療反應(yīng)的標(biāo)記物。
　　在開始上

4、述研究前,我們首先對目前在骨轉(zhuǎn)移疼痛的分子和病理機制以及治療藥物的基礎(chǔ)研究中使用的多種動物模型進行總結(jié)。并與臨床患者情況進行了擬合,以探尋目前常用的動物模型(小鼠和大鼠)與臨床骨轉(zhuǎn)移疼痛在疾病類型、骨轉(zhuǎn)移部位、骨轉(zhuǎn)移疼痛部位以及疼痛特點方面是否相符。試圖篩選出最貼近臨床特點的動物模型開展實驗研究,并嘗試對篩選出的動物模型進一步優(yōu)化操作,以發(fā)現(xiàn)最貼近臨床患者特點、最易于操作、損傷較小的新的骨轉(zhuǎn)移疼痛動物模型。
　　二、研究方法

5、>　?、宀煌前┩磩游锬Ｐ蛿M合臨床特征的研究
　　在Pubmed數(shù)據(jù)庫中檢索從1999年到2012年5月的骨腫瘤疼痛動物模型的研究文獻進行歸納總結(jié)。并采用回顧性研究,納入2010年5月至2011年3月在華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院腫瘤科住院的骨腫瘤患者以及2010年5月至2012年5月在該院就診的原發(fā)骨腫瘤患者,對患者一般資料、原發(fā)腫瘤部位、骨轉(zhuǎn)移部位和骨疼痛相關(guān)信息進行統(tǒng)計分析。
　?、婀寝D(zhuǎn)移疼痛新的大鼠模型:在大鼠股骨第三轉(zhuǎn)

6、子處種植大鼠乳腺癌細胞
　　在我們新建立的大鼠模型中,除了具備第一部分最佳擬合臨床的動物模型特點之外,進一步簡化操作,減少手術(shù)損傷,在大鼠股骨第三轉(zhuǎn)子處注射Walker256細胞。此處的解剖結(jié)構(gòu)相對簡單,并且注射鉆孔可以垂直進針,僅需破壞皮質(zhì)骨1-2mm深度,而不損傷遠端股骨。在種植術(shù)后觀察大鼠的疼痛行為和腫瘤生長21天,并進一步研究此模型中神經(jīng)化學(xué)改變。
　　㈢骨代謝標(biāo)記物NTx與大鼠骨轉(zhuǎn)移疼痛的關(guān)系研究
　　1.在

7、新建立的骨轉(zhuǎn)移疼痛大鼠模型基礎(chǔ)上,采用隨機對照研究,對大鼠股骨種植不同濃度(104個、105個或106個/10μl)腫瘤細胞以造成不同程度腫瘤進展,在種植術(shù)前和術(shù)后第7天、14天和21天分別測每組大鼠的機械性痛覺過敏縮爪閾值和尿NTx值。
　　2.再對注射相同濃度腫瘤細胞大鼠在種植術(shù)后第10天進行唑來膦酸、紫杉醇藥物治療干預(yù)和對照研究,在種植術(shù)前和術(shù)后第7天、14天和21天分別測每組大鼠的機械性痛覺過敏縮爪閾值和尿NTx值。

8、>　　3.并對術(shù)后第14天各組大鼠的種植肢行骨切片H&E染色和破骨細胞染色,觀察腫瘤侵犯和破骨細胞活性,再進一步檢測大鼠脊髓或脊髓背根神經(jīng)元內(nèi)c-fos、TRPV1和ASCI3的表達情況,探討疼痛與NTx關(guān)聯(lián)的潛在機制。
　　三、研究結(jié)果
　?、宀煌前┩磩游锬Ｐ蛿M合臨床特征的研究
　　1.共分析骨腫瘤疼痛動物研究文獻26篇,歸納總結(jié)成7種不同骨轉(zhuǎn)移疼痛動物模型。
　　2.對骨腫瘤患者的臨床分析結(jié)果顯示,95.3

9、%的骨腫瘤患者為骨轉(zhuǎn)移患者。骨轉(zhuǎn)移疼痛與原發(fā)骨腫瘤疼痛在發(fā)病年齡、疼痛是否為首發(fā)癥狀以及疼痛類型上均有顯著差異。四肢近端骨轉(zhuǎn)移較遠端骨更為常見。
　　3.注射轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞造模、股骨為成瘤點、測量方法中包含爆發(fā)痛測量的動物模型相對能夠較好模擬骨轉(zhuǎn)移疼痛臨床情況。
　?、婀寝D(zhuǎn)移疼痛新的大鼠模型:在大鼠股骨第三轉(zhuǎn)子處種植大鼠乳腺癌細胞
　　1.負瘤大鼠在種植術(shù)后第14天出現(xiàn)肢體使用評分明顯下降,第7天出現(xiàn)自發(fā)性縮爪和防衛(wèi)時

10、間的明顯上升,以及在第6天出現(xiàn)機械刺激縮爪閾值的明顯下降。
　　2.磁共振成像(MRI)結(jié)果顯示腫瘤隨時間推移而侵犯程度加重,并進一步由骨免疫組化證實了骨轉(zhuǎn)移。
　　3.負瘤大鼠中c-fos和TRPV1陽性神經(jīng)元數(shù)量較對照組明顯增加,而P物質(zhì)(SP)的表達則在兩組間無明顯差異,提示此腫瘤模型中神經(jīng)元被激活。
　?、绻谴x標(biāo)記物NTx與大鼠骨轉(zhuǎn)移疼痛的關(guān)系研究
　　1.大鼠骨轉(zhuǎn)移疼痛與尿NTx水平相關(guān)(r=0.87

11、3,p<0.001),而與尿NTx增長速率無關(guān)(r=0.265,p=0.181),并且大鼠尿NTx值與唑來膦酸和紫杉醇治療骨轉(zhuǎn)移疼痛的治療反應(yīng)呈正相關(guān)(r=0.619,p<0.001)。
　　2.大鼠骨組織切片顯示,腫瘤侵犯的范圍在各治療組和腫瘤對照組均無明顯區(qū)別,但在唑來膦酸治療組病變內(nèi)殘存骨小梁結(jié)構(gòu)較多,唑來膦酸組的破骨細胞活性明顯較腫瘤對照組降低。
　　3.唑來膦酸組的脊髓c-fos和脊髓背根神經(jīng)節(jié)ASCI3的mRNA

12、表達在治療早期(治療后第4天)即較腫瘤對照組明顯降低,而紫杉醇組的c-fos和脊髓背根神經(jīng)節(jié)ASCI3的mRNA表達較腫瘤對照組降低的差異出現(xiàn)得較晚(治療后第11天),而各治療組脊髓TRPV1mRNA表達較腫瘤對照組無明顯區(qū)別。
　　三、結(jié)論
　?、遄⑸滢D(zhuǎn)移性腫瘤細胞、股骨為成瘤點、測量方法中包含爆發(fā)痛測量的動物模型相對能夠較好模擬骨轉(zhuǎn)移疼痛臨床情況,其研究結(jié)果能較為有效的為臨床研究和治療提供參考。
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