骨代謝標(biāo)志物(NTx)與大鼠骨轉(zhuǎn)移疼痛的關(guān)系研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　骨轉(zhuǎn)移疼痛是惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移患者的常見癥狀,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。骨轉(zhuǎn)移疼痛由于經(jīng)常伴有爆發(fā)性疼痛,臨床上較為難治。目前對(duì)骨轉(zhuǎn)移疼痛的治療方法主要為非甾體抗炎藥、環(huán)氧化酶-2抑制劑、化療、放療、含氮的雙膦酸鹽類藥物以及阿片類藥物的單藥或多藥聯(lián)合治療。當(dāng)患者經(jīng)過(guò)上述治療后,如果仍然存在疼痛,甚至疼痛程度加重時(shí),需要鑒別未控制疼痛的原因是由于腫瘤進(jìn)展還是患者對(duì)治療藥物或方法無(wú)反應(yīng)或劑量不夠。而判斷骨轉(zhuǎn)移病變及

2、范圍的常規(guī)的影像學(xué)或放射性核素顯像無(wú)法精確定量骨損傷的量及速度。因此,需要一種簡(jiǎn)單的并且能快速和敏感的發(fā)現(xiàn)骨骼改變的評(píng)估方法,以至于能連續(xù)的監(jiān)測(cè)患者的病情進(jìn)展和評(píng)估藥物治療反應(yīng)。
　　近年來(lái),骨膠原代謝產(chǎn)物——I型膠原交聯(lián)氨基末端肽(NTx)以及I型膠原交聯(lián)碳端肽(CTx)逐步被人們所關(guān)注。I型膠原是骨組織中唯一的膠原,占骨基質(zhì)的90％。研究顯示,NTx單獨(dú)起源于I型膠原,并在骨吸收階段被破骨細(xì)胞激活而產(chǎn)生成一個(gè)新的表位,具有較高

3、特異性,是破骨細(xì)胞溶骨性改變的直接產(chǎn)物,并不會(huì)繼續(xù)代謝。通過(guò)采集血清或尿液標(biāo)本均可分析NTx水平,其中尿液檢測(cè)無(wú)創(chuàng)且易于收集,能反復(fù)多次進(jìn)行,有利于對(duì)患者的骨病變進(jìn)展和疼痛治療反應(yīng)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。
　　因此,本研究旨在探尋大鼠尿NTx及NTx的增長(zhǎng)速度是否與骨轉(zhuǎn)移疼痛及程度相關(guān)。并進(jìn)一步探討NTx與大鼠骨轉(zhuǎn)移瘤的化療、雙膦酸鹽治療的關(guān)系,從而判斷尿NTx是否能成為早期發(fā)現(xiàn)骨病變進(jìn)展和評(píng)估藥物疼痛治療反應(yīng)的標(biāo)記物。
　　在開始上

4、述研究前,我們首先對(duì)目前在骨轉(zhuǎn)移疼痛的分子和病理機(jī)制以及治療藥物的基礎(chǔ)研究中使用的多種動(dòng)物模型進(jìn)行總結(jié)。并與臨床患者情況進(jìn)行了擬合,以探尋目前常用的動(dòng)物模型(小鼠和大鼠)與臨床骨轉(zhuǎn)移疼痛在疾病類型、骨轉(zhuǎn)移部位、骨轉(zhuǎn)移疼痛部位以及疼痛特點(diǎn)方面是否相符。試圖篩選出最貼近臨床特點(diǎn)的動(dòng)物模型開展實(shí)驗(yàn)研究,并嘗試對(duì)篩選出的動(dòng)物模型進(jìn)一步優(yōu)化操作,以發(fā)現(xiàn)最貼近臨床患者特點(diǎn)、最易于操作、損傷較小的新的骨轉(zhuǎn)移疼痛動(dòng)物模型。
　　二、研究方法

5、>　?、宀煌前┩磩?dòng)物模型擬合臨床特征的研究
　　在Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索從1999年到2012年5月的骨腫瘤疼痛動(dòng)物模型的研究文獻(xiàn)進(jìn)行歸納總結(jié)。并采用回顧性研究,納入2010年5月至2011年3月在華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科住院的骨腫瘤患者以及2010年5月至2012年5月在該院就診的原發(fā)骨腫瘤患者,對(duì)患者一般資料、原發(fā)腫瘤部位、骨轉(zhuǎn)移部位和骨疼痛相關(guān)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　?、婀寝D(zhuǎn)移疼痛新的大鼠模型:在大鼠股骨第三轉(zhuǎn)

6、子處種植大鼠乳腺癌細(xì)胞
　　在我們新建立的大鼠模型中,除了具備第一部分最佳擬合臨床的動(dòng)物模型特點(diǎn)之外,進(jìn)一步簡(jiǎn)化操作,減少手術(shù)損傷,在大鼠股骨第三轉(zhuǎn)子處注射Walker256細(xì)胞。此處的解剖結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,并且注射鉆孔可以垂直進(jìn)針,僅需破壞皮質(zhì)骨1-2mm深度,而不損傷遠(yuǎn)端股骨。在種植術(shù)后觀察大鼠的疼痛行為和腫瘤生長(zhǎng)21天,并進(jìn)一步研究此模型中神經(jīng)化學(xué)改變。
　　㈢骨代謝標(biāo)記物NTx與大鼠骨轉(zhuǎn)移疼痛的關(guān)系研究
　　1.在

7、新建立的骨轉(zhuǎn)移疼痛大鼠模型基礎(chǔ)上,采用隨機(jī)對(duì)照研究,對(duì)大鼠股骨種植不同濃度(104個(gè)、105個(gè)或106個(gè)/10μl)腫瘤細(xì)胞以造成不同程度腫瘤進(jìn)展,在種植術(shù)前和術(shù)后第7天、14天和21天分別測(cè)每組大鼠的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏縮爪閾值和尿NTx值。
　　2.再對(duì)注射相同濃度腫瘤細(xì)胞大鼠在種植術(shù)后第10天進(jìn)行唑來(lái)膦酸、紫杉醇藥物治療干預(yù)和對(duì)照研究,在種植術(shù)前和術(shù)后第7天、14天和21天分別測(cè)每組大鼠的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏縮爪閾值和尿NTx值。

8、>　　3.并對(duì)術(shù)后第14天各組大鼠的種植肢行骨切片H&E染色和破骨細(xì)胞染色,觀察腫瘤侵犯和破骨細(xì)胞活性,再進(jìn)一步檢測(cè)大鼠脊髓或脊髓背根神經(jīng)元內(nèi)c-fos、TRPV1和ASCI3的表達(dá)情況,探討疼痛與NTx關(guān)聯(lián)的潛在機(jī)制。
　　三、研究結(jié)果
　?、宀煌前┩磩?dòng)物模型擬合臨床特征的研究
　　1.共分析骨腫瘤疼痛動(dòng)物研究文獻(xiàn)26篇,歸納總結(jié)成7種不同骨轉(zhuǎn)移疼痛動(dòng)物模型。
　　2.對(duì)骨腫瘤患者的臨床分析結(jié)果顯示,95.3

9、%的骨腫瘤患者為骨轉(zhuǎn)移患者。骨轉(zhuǎn)移疼痛與原發(fā)骨腫瘤疼痛在發(fā)病年齡、疼痛是否為首發(fā)癥狀以及疼痛類型上均有顯著差異。四肢近端骨轉(zhuǎn)移較遠(yuǎn)端骨更為常見。
　　3.注射轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞造模、股骨為成瘤點(diǎn)、測(cè)量方法中包含爆發(fā)痛測(cè)量的動(dòng)物模型相對(duì)能夠較好模擬骨轉(zhuǎn)移疼痛臨床情況。
　?、婀寝D(zhuǎn)移疼痛新的大鼠模型:在大鼠股骨第三轉(zhuǎn)子處種植大鼠乳腺癌細(xì)胞
　　1.負(fù)瘤大鼠在種植術(shù)后第14天出現(xiàn)肢體使用評(píng)分明顯下降,第7天出現(xiàn)自發(fā)性縮爪和防衛(wèi)時(shí)

10、間的明顯上升,以及在第6天出現(xiàn)機(jī)械刺激縮爪閾值的明顯下降。
　　2.磁共振成像(MRI)結(jié)果顯示腫瘤隨時(shí)間推移而侵犯程度加重,并進(jìn)一步由骨免疫組化證實(shí)了骨轉(zhuǎn)移。
　　3.負(fù)瘤大鼠中c-fos和TRPV1陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組明顯增加,而P物質(zhì)(SP)的表達(dá)則在兩組間無(wú)明顯差異,提示此腫瘤模型中神經(jīng)元被激活。
　?、绻谴x標(biāo)記物NTx與大鼠骨轉(zhuǎn)移疼痛的關(guān)系研究
　　1.大鼠骨轉(zhuǎn)移疼痛與尿NTx水平相關(guān)(r=0.87

11、3,p<0.001),而與尿NTx增長(zhǎng)速率無(wú)關(guān)(r=0.265,p=0.181),并且大鼠尿NTx值與唑來(lái)膦酸和紫杉醇治療骨轉(zhuǎn)移疼痛的治療反應(yīng)呈正相關(guān)(r=0.619,p<0.001)。
　　2.大鼠骨組織切片顯示,腫瘤侵犯的范圍在各治療組和腫瘤對(duì)照組均無(wú)明顯區(qū)別,但在唑來(lái)膦酸治療組病變內(nèi)殘存骨小梁結(jié)構(gòu)較多,唑來(lái)膦酸組的破骨細(xì)胞活性明顯較腫瘤對(duì)照組降低。
　　3.唑來(lái)膦酸組的脊髓c-fos和脊髓背根神經(jīng)節(jié)ASCI3的mRNA

12、表達(dá)在治療早期(治療后第4天)即較腫瘤對(duì)照組明顯降低,而紫杉醇組的c-fos和脊髓背根神經(jīng)節(jié)ASCI3的mRNA表達(dá)較腫瘤對(duì)照組降低的差異出現(xiàn)得較晚(治療后第11天),而各治療組脊髓TRPV1mRNA表達(dá)較腫瘤對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別。
　　三、結(jié)論
　　㈠注射轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞、股骨為成瘤點(diǎn)、測(cè)量方法中包含爆發(fā)痛測(cè)量的動(dòng)物模型相對(duì)能夠較好模擬骨轉(zhuǎn)移疼痛臨床情況,其研究結(jié)果能較為有效的為臨床研究和治療提供參考。
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