IMb-DM122抗HCV藥效學(xué)研究.pdf

1、丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染引起的一種重大傳染性疾病，呈全球性流行，導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)病率和致死率。鑒于現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)治療方案(聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)與利巴韋林（RBV）聯(lián)合治療）的總體療效有限，并且尚無(wú)針對(duì)丙型肝炎的預(yù)防疫苗，因此研發(fā)新型的抗HCV藥物迫在眉睫。近年來(lái)，隨著直接作用于病毒蛋白的抗病毒藥物(direct-acting antiviral agents，DAAs)逐漸在臨床上的

2、應(yīng)用，為治愈丙型肝炎帶來(lái)了希望，但是DAAs長(zhǎng)期使用易誘發(fā)產(chǎn)生病毒耐藥。為克服這一問(wèn)題，科學(xué)家們將研發(fā)重點(diǎn)轉(zhuǎn)向聯(lián)合用藥，和開(kāi)發(fā)以宿主細(xì)胞蛋白為靶點(diǎn)的抗病毒藥物。我們研究團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)化合物IMB-DM122是一個(gè)以宿主細(xì)胞蛋白為靶點(diǎn)的新型的抗HCV候選化合物，毒性低。其抗HCV的作用是通過(guò)作用于HSC70 mRNA的3'UTR反應(yīng)元件降低其穩(wěn)定性，下調(diào)胞內(nèi)HSC70蛋白的表達(dá)，從而減少病毒包裝至病毒顆粒內(nèi)HSC70蛋白水平，降低子代病

3、毒的感染力，最終起到抗HCV復(fù)制的作用。但I(xiàn)MB-DM122作用效果和作用特點(diǎn)仍有待深入分析，這也是本論文的研究?jī)?nèi)容。
　　本論文第一部分優(yōu)化了蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)半定量分析方法，在此基礎(chǔ)上，論文第二部分進(jìn)一步探討了IMB-DM122抗HCV的藥效學(xué)作用及其優(yōu)點(diǎn)。
　　本論文首先提取了HCV感染的Huh7.5細(xì)胞內(nèi)總蛋白，經(jīng)定量后，以HCV編碼的核心蛋白(Core)為目的蛋白，以管家基因編碼的蛋白T

4、ubulin或Gapdh為內(nèi)參對(duì)照，分析蛋白上樣量、抗體濃度及孵育時(shí)間、發(fā)光液濃度等可變因素對(duì)WB半定量分析結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，WB半定量結(jié)果中目的蛋白相對(duì)強(qiáng)度與蛋白總上樣量之間只在一定上樣量范圍內(nèi)有線性關(guān)系，超出線性范圍會(huì)導(dǎo)致相對(duì)蛋白強(qiáng)度變化幅度減少，甚至無(wú)變化;上樣體積、內(nèi)參的選擇不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果;在條帶質(zhì)量較好的前提下，一抗?jié)舛燃捌浞跤龝r(shí)間和發(fā)光液濃度也不改變實(shí)驗(yàn)結(jié)果;但是半定量有一定的缺陷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的誤差，應(yīng)在15％以?xún)?nèi)

5、。因此，影響WB半定量結(jié)果的主要因素仍為目的蛋白的上樣量;在能獲得條帶質(zhì)量較好的前提下，改變上樣體積和抗體孵育時(shí)間、適當(dāng)稀釋抗體和發(fā)光液濃度有利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)展而不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　在分析了WB半定量結(jié)果影響因素之后，本論文進(jìn)一步探討了IMB-DM122在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抗HCV作用效果及其特點(diǎn)。結(jié)果顯示，IMB-DM122不僅在急性感染的細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)具有抗HCV活性，在長(zhǎng)期感染的Huh7.5細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)也具有抗HCV活性，且存在一定的劑量依賴(lài)

6、性以及時(shí)效性;隨后，通過(guò)聯(lián)合給藥的實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)，IMB-DM122聯(lián)合IFN或VX-950能增強(qiáng)抗HCV的活性，相比于單獨(dú)給藥組，聯(lián)合給藥處理的細(xì)胞，具有更為顯著的抗HCV的效果。緊接著，本論文分析了IMB-DM122對(duì)耐藥HCV的抗病毒活性。通過(guò)陽(yáng)性藥物Simepervir和Sofosbuvir處理HCV感染的Huh7.5細(xì)胞，使其產(chǎn)生耐藥，獲得耐藥病毒株，分析IMB-DM122對(duì)耐藥株的抗病毒活性。結(jié)果顯示，IMB-DM122對(duì)耐藥

7、病毒株也顯示了同樣的抗病毒活性。最后，本論文探究了IMB-DM122對(duì)其作用靶點(diǎn)家族的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IMB-DM122的抗HCV作用主要是通過(guò)降低HSC70這一特異性靶點(diǎn)發(fā)揮作用的，而對(duì)HSP70家族中的其它成員HSP70、GRP75和GRP78作用不明顯，對(duì)其它熱休克蛋白如HSP90、HSP60的作用也不明顯，說(shuō)明IMB-DM122的作用靶點(diǎn)具有特異性。
　　本論文結(jié)論及其意義:IMB-DM122不僅在急性感染的細(xì)胞培養(yǎng)