IMb-DM122抗HCV藥效學研究.pdf

1、丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染引起的一種重大傳染性疾病，呈全球性流行，導致嚴重的發(fā)病率和致死率。鑒于現有的標準治療方案(聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)與利巴韋林（RBV）聯合治療）的總體療效有限，并且尚無針對丙型肝炎的預防疫苗，因此研發(fā)新型的抗HCV藥物迫在眉睫。近年來，隨著直接作用于病毒蛋白的抗病毒藥物(direct-acting antiviral agents，DAAs)逐漸在臨床上的

2、應用，為治愈丙型肝炎帶來了希望，但是DAAs長期使用易誘發(fā)產生病毒耐藥。為克服這一問題，科學家們將研發(fā)重點轉向聯合用藥，和開發(fā)以宿主細胞蛋白為靶點的抗病毒藥物。我們研究團隊實驗研究發(fā)現化合物IMB-DM122是一個以宿主細胞蛋白為靶點的新型的抗HCV候選化合物，毒性低。其抗HCV的作用是通過作用于HSC70 mRNA的3'UTR反應元件降低其穩(wěn)定性，下調胞內HSC70蛋白的表達，從而減少病毒包裝至病毒顆粒內HSC70蛋白水平，降低子代病

3、毒的感染力，最終起到抗HCV復制的作用。但IMB-DM122作用效果和作用特點仍有待深入分析，這也是本論文的研究內容。
　　本論文第一部分優(yōu)化了蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)半定量分析方法，在此基礎上，論文第二部分進一步探討了IMB-DM122抗HCV的藥效學作用及其優(yōu)點。
　　本論文首先提取了HCV感染的Huh7.5細胞內總蛋白，經定量后，以HCV編碼的核心蛋白(Core)為目的蛋白，以管家基因編碼的蛋白T

4、ubulin或Gapdh為內參對照，分析蛋白上樣量、抗體濃度及孵育時間、發(fā)光液濃度等可變因素對WB半定量分析結果的影響。結果顯示，WB半定量結果中目的蛋白相對強度與蛋白總上樣量之間只在一定上樣量范圍內有線性關系，超出線性范圍會導致相對蛋白強度變化幅度減少，甚至無變化;上樣體積、內參的選擇不影響實驗結果;在條帶質量較好的前提下，一抗?jié)舛燃捌浞跤龝r間和發(fā)光液濃度也不改變實驗結果;但是半定量有一定的缺陷，實驗結果存在一定的誤差，應在15％以內

5、。因此，影響WB半定量結果的主要因素仍為目的蛋白的上樣量;在能獲得條帶質量較好的前提下，改變上樣體積和抗體孵育時間、適當稀釋抗體和發(fā)光液濃度有利于實驗進展而不影響實驗結果。
　　在分析了WB半定量結果影響因素之后，本論文進一步探討了IMB-DM122在細胞培養(yǎng)內抗HCV作用效果及其特點。結果顯示，IMB-DM122不僅在急性感染的細胞培養(yǎng)內具有抗HCV活性，在長期感染的Huh7.5細胞培養(yǎng)內也具有抗HCV活性，且存在一定的劑量依賴

6、性以及時效性;隨后，通過聯合給藥的實驗探究發(fā)現，IMB-DM122聯合IFN或VX-950能增強抗HCV的活性，相比于單獨給藥組，聯合給藥處理的細胞，具有更為顯著的抗HCV的效果。緊接著，本論文分析了IMB-DM122對耐藥HCV的抗病毒活性。通過陽性藥物Simepervir和Sofosbuvir處理HCV感染的Huh7.5細胞，使其產生耐藥，獲得耐藥病毒株，分析IMB-DM122對耐藥株的抗病毒活性。結果顯示，IMB-DM122對耐藥

7、病毒株也顯示了同樣的抗病毒活性。最后，本論文探究了IMB-DM122對其作用靶點家族的特異性。實驗結果顯示，IMB-DM122的抗HCV作用主要是通過降低HSC70這一特異性靶點發(fā)揮作用的，而對HSP70家族中的其它成員HSP70、GRP75和GRP78作用不明顯，對其它熱休克蛋白如HSP90、HSP60的作用也不明顯，說明IMB-DM122的作用靶點具有特異性。
　　本論文結論及其意義:IMB-DM122不僅在急性感染的細胞培養(yǎng)