硫酸鈣復(fù)合鹿瓜多肽人工骨材料的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　本研究利用α-半水硫酸鈣與鹿瓜多肽注射液，按照一定的比例，經(jīng)過特定的復(fù)合過程，將其轉(zhuǎn)化為具有生物活性的復(fù)合人工骨材料。并從材料的理化性質(zhì)、生物相容性以及成骨活性三方面對(duì)制備的骨材料進(jìn)行檢測(cè)。本研究為進(jìn)一步研究硫酸鈣的骨缺損修復(fù)機(jī)制和臨床上應(yīng)用這種骨材料提供初步的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。
　　方法:
　　一、硫酸鈣/鹿瓜多肽復(fù)合人工骨材料的制備及理化性質(zhì)檢測(cè)。
　　將鹿瓜多肽注射液與雙蒸水分別按照1∶0、1∶1、

2、1∶2的比例混合均勻，作為固化液。然后將α-半水硫酸鈣適量固化液混合，充分?jǐn)嚢杌靹颍粱旌衔锍誓z狀后，將漿料注入不同規(guī)格的模具內(nèi)，常溫下待液體揮發(fā)，固化，最后環(huán)氧乙烷消毒。掃描電鏡下觀察材料表面形態(tài)，壓力測(cè)試儀檢測(cè)復(fù)合人工骨的抗壓性能。
　　二、硫酸鈣/鹿瓜多肽復(fù)合人工骨材料的生物相容性研究。
　　根據(jù)體外材料毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)IS010993-5及GB/T16886-1，從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平兩方面進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):A、CCK8細(xì)胞

3、毒性試驗(yàn)，B、電鏡下細(xì)胞在材料表面粘附試驗(yàn)，C、體內(nèi)急性毒性反應(yīng)試驗(yàn)，D、溶血實(shí)驗(yàn)，E、骨缺損植入試驗(yàn)。
　　三、硫酸鈣/鹿瓜多肽復(fù)合人工骨材料的成骨活性研究
　　從體內(nèi)和體外兩方面實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)硫酸鈣/鹿瓜多肽復(fù)合人工骨材料的成骨活性
　　A、體外試驗(yàn):以復(fù)合人工骨的培養(yǎng)基浸出液來培養(yǎng)成骨細(xì)胞，ALP試驗(yàn)評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞增殖活性，Q rt-pcr檢測(cè)相關(guān)成骨活性因子的表達(dá)水平。B、體內(nèi)試驗(yàn):制作兔股骨遠(yuǎn)端骨缺損模型，然后分

4、對(duì)照組和不同的實(shí)驗(yàn)組，各組分別植入相關(guān)的人工骨，分批于術(shù)后2周、4周、8周及12周處死，觀察以下指標(biāo):1、動(dòng)物一般情況觀察;2、術(shù)前及術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)平片觀察人工骨的降解以及新骨形成的情況;3、標(biāo)本常規(guī)病理切片，HE染色觀察成骨情況。
　　結(jié)果:
　　一、硫酸鈣/鹿瓜多肽復(fù)合人工骨材料的制備及理化性質(zhì)檢測(cè)。
　　按照上述制備方法，得到不同規(guī)格的人工骨材料。電鏡下觀察見材料表面硫酸鈣晶體排列緊密?？箟涸囼?yàn)表明復(fù)合人工骨的抗壓

5、強(qiáng)度能夠?yàn)楣侨睋p處提供足夠的支撐。
　　二、硫酸鈣/鹿瓜多肽復(fù)合人工骨材料的生物相容性研究。
　　A、CCK8細(xì)胞毒性試驗(yàn):與單純硫酸鈣對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的成骨細(xì)胞增殖更加活躍。B、電鏡下細(xì)胞在材料表面粘附試驗(yàn):掃描電鏡下可見成骨細(xì)胞在材料表面粘附，呈梭形，形態(tài)飽滿，并有大量偽足伸出，細(xì)胞間有突起相連。細(xì)胞種植后第3天與第7天電鏡結(jié)果相比，可見成骨細(xì)胞增殖明顯。C、體內(nèi)急性毒性反應(yīng)試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)兔子的心肝肺腎等重要臟器均表現(xiàn)正常

6、，未見正常細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象。D、溶血實(shí)驗(yàn):人工骨材料植入機(jī)體后不會(huì)引起溶血反應(yīng)。E、骨缺損植入試驗(yàn):病理切片顯示材料周圍的組織情況良好，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　三、硫酸鈣/鹿瓜多肽復(fù)合人工骨材料的成骨活性研究
　　A:實(shí)驗(yàn)組ALP活性明顯升高。人工骨材料能夠提高成骨細(xì)胞BMP-2、TGF-β等成骨活性因子的表達(dá)，具有一定的骨誘導(dǎo)活性。B:1、動(dòng)物一般情況觀察:人工骨材料植入后，兔子全身情況穩(wěn)定，未見異常反應(yīng)

7、，手術(shù)切口正常愈合，無感染，術(shù)后動(dòng)物均正常生長(zhǎng)，未見死亡。2、平片觀察:實(shí)驗(yàn)組2周時(shí)骨缺損區(qū)清晰，4周時(shí)有少量骨痂形成;術(shù)后8周時(shí)，難以見到植入的人工骨，骨缺損區(qū)內(nèi)骨痂逐漸增多;12周時(shí)骨缺損區(qū)內(nèi)有大量新生骨質(zhì)填充，骨缺損基本修復(fù)。硫酸鈣組各時(shí)期成骨要慢于實(shí)驗(yàn)組。3、病理切片:實(shí)驗(yàn)組2周時(shí)見材料外層極少量纖維組織形成，4周時(shí)見材料外層降解，大量纖維組織形成?？梢娚倭啃鹿切纬桑?周時(shí)材料大部分降解，新骨量明顯增加，12周新骨基本填充骨缺損